z在：孙永欣 1，田 斌 2，任同军 3，刘宪杰 4，王庆志 1 （1.辽宁省海洋水产科学研究院，大连市海产贝类种质资源创新利用重点实验室，辽宁 大连 116023； 2.大连现代农业生产发展服务中心，辽宁 大连 116023；3.大连海洋大学，水产与生命学院，辽宁 大连 116023；4.大连海洋大学，创新创业学院，辽宁 大连 116023）

关键词：微生物；循环水养殖；生物过滤器；应用

近 50 年来，水产养殖已经从小规模商业模式发展到大型规模化养殖模式，数据显示， 通过养殖收获的水产品从 20 世纪 70 年代初仅占水产品消费总量的 6%，上升到 2018 年的 46%[1]。而全球人口不断增加进一步加大对养殖水产品的需求量。随着养殖密度的不断提升 及水资源的无序利用，开放式流水工厂化养殖模式暴露出地下井水资源遭受破坏、病害逐年 增多、食品安全需求，加之沿海工业用地挤压和全球倡导节能减排等多重压力，其发展已经 面临一个新的瓶颈，养殖模式亟待转变。在此基础上，一种全新概念的封闭式工厂化循环水 养殖系统模式应运而生，它可以充分利用有限的环境资源条件实现养殖的可持续性发展。循 环水养殖系统可以在最佳条件下，对养殖生物活动产生的排泄物进行高效管理、收集和处理， 除蒸发损失和补充微滤机反冲水，全程无需添加新水[2-4]。 开发高效、高产、环保的循环水养殖系统需要从物理参数（溶解氧、温度、臭氧、紫外 线、pH 和盐度）到生物过滤系统的所有养殖条件进行深入了解。物理参数相对可控，但生 物过滤系统受到微生物群落之间相互作用以及有机废物输入的影响而难以控制。直到 20 年 前人们对生物滤器的微生物组成还知之甚少，当时的生物滤器通常采用高度组织化的生物膜 结构。人们对相关微生物活动的研究也比较浅显，主要集中在细菌培养和富集技术上，而传 统方法培养出来的微生物种类还不到利用现代分子技术鉴定到细菌种类的 1%[5]。借助现代 分子技术不仅能鉴定出微生物的类别，还可以帮助我们了解微生物活动、明确微生物区系间 交互影响，并为新型循环水养殖系统生物滤器设计以及过滤系统监控提供重要手段。笔者对 海水循环水养殖系统生物滤器中的微生物群落代谢反应、养殖系统中微生物种类及其在海水 动物养殖中的应用进展作一总结，为提高我国海水循环水养殖技术和管理提供参考。
1 海水循环水养殖系统生物滤器中的微生物群落代谢反应 虽然常规化生物过滤装置得到快速发展，但对于不同养殖品种，生物滤器的构造仍各不 相同[2-4,6]。一般来说，生物滤器是由可供微生物附着生长的固定介质或供微生物悬挂生长的 生物膜组成[7-8]。无论是用于海水、淡水、水族箱还是大型养殖系统，生物滤器都是由有氧 和厌氧微生物共同参与，协调发挥废物清除作用。水体中废物主要由鱼类排泄的氨氮、残饵 与粪便中的有机碳和氮组成[7-11]。循环水养殖系统生物滤器的主要代谢反应见表 1。

1.1 硝化作用 对于所有循环水养殖系统来说，硝化生物滤器对于维持水体氨氮安全性浓度至关重要， 通常非离子氨（NH3-N）的亚致死质量浓度为 0.1～3.0 mg/L，还要取决于养殖物种、pH 和 盐度等参数，而离子状态的 NH4 +则相对无害[27]。循环水养殖系统中发现与氨氧化相关的细 菌主要是亚硝化单胞菌属和亚硝化球菌属（表 1），后者主要存在于半咸水或海洋硝化系统 [12-14,16,28]。水产动物对氨氧化的初产物——亚硝酸盐的耐受程度较高，但长期暴露在低水平 质量浓度（<0.2 mg/L）下也会产生不利影响。在亚硝化生物滤器上，亚硝酸盐和氨的氧化 作用同时发生，β-变形菌纲中的硝化螺旋菌属是行使亚硝酸盐氧化的主要微生物种类（表 1）。

1.2 异养和自养反硝化作用 在厌氧条件下（专用隔间或生物膜层深处），来自于残饵和鱼类排泄物中的高浓度硝酸 盐、亚硝酸盐和有机碳[29]更容易导致海水循环水养殖系统中发生异养反硝化作用[10]（表 1）。

在海水循环水养殖系统硝化菌落中富集了厌氧条件下高浓度硝酸盐诱导出来的异养反 硝化功能菌，包括假单胞菌属、水螺菌属（Aquaspirillum）和各种 α-变形菌，它们很可能参 与硝酸盐还原作用。其中，假单胞菌属是海水循环水养殖系统硝化过滤器中丰度最高的 γ变形菌[19-21]。随着反硝化作用研究不断深入，相继鉴定出多种碳利用菌。Cytryn 等[22]在零 交换海水养殖系统的消化池入口检测到颗粒有机碳偏好菌，均属于发酵型细菌，包括 Fusibacteria、脱硫代硫酸盐弧菌（Dethiosulfovibrio sp.）和拟杆菌门家族成员。Tal 等[14]在 海水循环水养殖系统移动床生物反应器生物滤膜上发现了高活性反硝化菌，属于假单胞菌属， 在系统添加醋酸钠后，其反硝化活性显著提高。Borges 等[19]从海水循环水养殖系统中分离 出 T2 菌株，经鉴定为一种新型的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），能高效利用水 体中碳源，利用反硝化作用将硝酸盐转化为氮气。张兰河等[30]以聚羟基丁酸戊酸共聚酯作 为淡水循环水养殖系统生物膜载体，鉴定出降解菌，分别为嗜酸菌属（Acidovorax）、甲基 化石油杆菌属（ Methylibium ） 、 假 黄 单 胞 菌 属 （ Pseudoxanthomonas ） 和 脱 氯 菌 属 （Dechloromonas），明确了反硝化反应器运行过程中碳源表面生物膜优势菌群。 此外，海洋循环水养殖系统生物滤器还检测出硫化物依赖型自养反硝化细菌，包括拟杆 菌门、变形菌门、厚壁菌门和互养菌门（表 1）[17-18,20,22,31]。其活性随着海水中硫酸盐升高 而升高，硫化物自养反硝化作用也是厌氧条件下硫基氧化—还原循环的一个环节。在该循环 中，微生物氧化有机废物，将硫酸盐还原为硫化物，并且在硫化物自养反硝化作用下生成氮 气（表 1）[3,22,32]。在海洋循环水养殖系统污泥消化池中已鉴定到的硫化物自养反硝化细菌 包括脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、脱硫代硫酸盐弧菌属、梭状杆菌属（Fusobacterium）和 拟杆菌属（Bacterioidetes）[22]。 有毒硫化物的清除及硫酸盐再生反应需要在有氧条件下硫化物氧化细菌参与，例如硫螺 旋菌属（Thiomicrospira）[18]。但在无氧条件下，硫化物很容易被化能自养脱氮硫化物氧化 菌氧化，这些细菌包括 ε-变形菌纲的反硝化硫微螺菌，β-变形菌纲的嗜氢菌属，γ-变形菌纲 的发硫菌属（Thiothrix），以及代谢多样性的 α-变形菌纲的红细菌（Rhodobacter eacea）[17-18]。

1.3 硝酸盐异化还原成铵 循环水养殖系统生物滤器中如果具有高碳氮比和高含量的硫化物，就可以发生硝酸盐异 化还原成铵反应，此反应中，硝酸盐和亚硝酸盐含量减少而氨氮浓度增加[10]。在有利于硝 酸盐异化还原成铵反应的条件下发现了 α-变形菌纲的副球菌属和氨基杆菌属（Aminobacter）， β-变形菌纲的产碱杆菌属（Alcaligenes）、固氮弧菌属（Azoarcus）和 δ-变形菌纲的脱硫弧 菌等硝酸盐还原菌，说明这些微生物参与了该反应[22]。

1.4 厌氧氨氧化 除反硝化类菌群，海洋循环水养殖系统过滤器上还检测出厌氧氨氧化浮霉菌目细菌（表 1）。该反应可绕过部分反硝化反应，直接将氨和亚硝酸盐转化为氮气，可以显著节省运行 成本和减少一氧化二氮排放[33]。对于循环水养殖系统来说，厌氧氨氧化途径对于氨的清除 非常重要，但由于相关细菌对有机酸敏感且增殖周期过长（>11 d），因此尚不能取代反硝 化作用[3,23,34]。因此，在循环水养殖系统厌氧生物滤器中，厌氧氨氧化与反硝化反应共同承 担氮废物处理，这与自然环境中以及大型污水处理厂处理方式相同[33,35-36]。

1.5 甲烷生成 虽然循环水养殖系统生物滤器的有氧和厌氧微生物活动能显著降低氮等有机物质，但完 全去除水溶性和固体有机废物是循环水养殖系统运行中的最大难题。来自于残饵和鱼类粪便 中的固体有机废物，通常经过收集后用于土地施肥或堆肥。对于来自于淡水系统的固体有机 废物，这种方法会造成环境方面的隐患，并面临监管审查。对于来自于海洋系统的固定有机 废物，由于存在浓缩盐问题，未来极可能在农业中禁用。 目前正在研究利用常驻微生物群落消除海洋循环水养殖系统中的固体有机废物，焦点集中在如何提高产甲烷古细菌厌氧消化反应的活性[3]。虽然海洋循环水养殖系统污泥中的高盐 度能抑制产甲烷古细菌活性，但在一些海洋循环水养殖系统中仍能检测到含量低于生产和生 活污泥消化产生的甲烷气体[37]。在半咸水产养殖污泥消化池中发现的古细菌为广古菌门和 泉古菌门细菌。 2 海水循环水养殖系统过滤系统中微生物群落多样性研究 利用 16S rRNA、功能基因特异性探针或 16S rRNA 基因库技术研究表明，生物过滤系 统中的细菌包括放线菌门、拟杆菌门/绿菌门、厚壁菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌目和变形 菌门，偶尔可见绿弯菌门、互养菌门和最新鉴定到的古细菌[12,28,38]（表 2）。 由于养殖水体和养殖品种均具有特定且复杂的微生物环境，造成了不同循环水养殖系统 中生物群落差异极大。为探明过滤器微生物群落相对丰度变化情况，赵越[39]采用高通量 16S rRNA 基因扩增测序的方研究移动床生物膜反应器启动阶段建立的生物膜微生物群落，研究 表明，在整个启动阶段（78 d），变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度之和占总细菌 丰度的 95%以上。在属水平上，亚硝化类细菌的相对丰度呈现降低—增加—降低的趋势， 根据数据分析，亚硝化类细菌的相对丰度和总氨氮的去除效率成正比的关系。与亚硝化类细 菌的变化趋势不同，硝化类细菌的相对丰度呈现不断增加的趋势，随着移动床生物膜反应器 的继续运行，到第 78 天时生物膜样品中亚硝化类细菌和硝化类细菌比值从首次测定时的 26:1 逐渐降低到越来越接近 1:1。Li 等[40]研究证实，在废水处理过程中，亚硝化类细菌和硝 化类细菌定殖速度的不平衡造成了亚硝酸盐的积累。Tal 等[14]研究也发现，在全封闭海水循 环水养殖系统中，硝化类细菌的定殖速度相对于亚硝化类细菌较慢。因此，生物膜上硝化细 菌群落的结构决定了硝化性能。
3 循环水养殖系统滤器中的致病菌和益生菌 通过细菌培养和 16S rRNA 序列显示，在循环水养殖系统生物滤膜中，存在弧菌属、欧 文氏菌属（Erwinia）、柯氏杆菌属（Coxiella）和气单胞菌属（Aeromonas）等致病性细菌[20-21,31]。虽然抗生素可有效杀灭病原微生物，但鉴于细菌产生抗药性并导致严重后果，目前一般结合 紫外线和臭氧方法防止细菌性感染。这些致病菌往往在循环水养殖系统生物滤膜内积聚[45-46]， 并极可能感染鱼类并且威胁消费者健康。当前，抑制病原体定殖的方法多采用益生菌，这些 细菌可以竞争营养、产生生长抑制剂、阻断细胞间的通讯等导致致病菌在生物膜内被瓦解 [47-49]。现已从循环水养殖系统生物滤器中鉴定到的益生菌包括芽孢杆菌属、假单胞菌属[49] 和玫瑰杆菌属[50]等（表 2），关于它们影响致病菌定殖作用机理有待于进一步研究。

4 循环水养殖系统水体中细菌群落分析 循环水养殖水体中微生物情况与养殖鱼类的生长、健康密切相关，其群落结构指示着鱼 体身体健康变化情况。有关循环水养殖系统微生物群落结构的研究一直备受关注，健康水体 中，优势菌比较固定，均为变形菌门和拟杆菌门细菌[51-54]。一旦养殖动物患病，水体中细菌 群落即发生变化。侯婷婷[55]对比分析健康和患病青石斑鱼（Epinephelus awoara）养殖水体 中微生物群落，发现健康水体优势门为变形菌门、拟杆菌门和疣微菌门，相对丰度分别为 52.5%、20.9%和 10.9%。优势纲 γ-变形菌纲、黄杆菌纲、疣微菌纲和 α-变形菌纲，相对丰 度分别为 40.5%、17.6%、10.9%和 10.9%；而患病水体中优势门发生改变，分别为变形菌门、 疣微菌门和拟杆菌门，相对丰度分别为 49.0%、26.4%和 12.3%；优势纲变为疣微菌纲、α变形菌纲、γ-变形菌纲和黄杆菌纲，相对丰度分别为 26.38%、25.07%、22.74%和 9.05%。 进一步核心微生物分析表明，患病水体核心属主要包括弧菌属、Owenweeksia 和假交替单胞 菌属等鱼类的病原菌或条件致病菌，而引起鱼体发生疾病的病原体正是弧菌属。同样，吴建 绍等[54]对健康和患病双斑东方鲀（Takifugu bimaculatus）循环水养殖系统养殖水体细菌种群 结构特征进行研究，结果显示，健康水体优势菌分别为拟杆菌门（相对丰度 57.887%，下同）， 变形菌门（39.83%）和疣微菌门（1.55%），患病水体中优势菌依次为变形菌门（71.23%）， 拟杆菌门（26.86%）和疣微菌门（0.94%）；在核心微生物(属)的分类水平上，患病的养殖 水体核心菌属为发光杆菌属(16.95%)、弧菌属(15.05%)、亮发菌属（Leucothrix）(12.19%)、 极地杆菌属（Polaribacter）(9.32%)、假交替单胞菌属(7.19%)，导致鱼体发生疾病病原体为 哈维氏弧菌（V. harveyi）。由此可见，在循环水养殖系统水体中，动物的不同健康状态存在 不同的微生物群落结构，这为循环水养殖系统病害防治系统的预警提供了有利的参考，并且 核心微生物群的动态变化可为弧菌病害的监测提供参考。

5 环境因子对循环水养殖系统水体细菌群落的影响 环境因素对细菌群落多样性和种类具有不同程度的影响，其中，温度、溶解氧、pH、 硝态氮浓度和化学需氧量对水体细菌群落影响较大。罗金飞等[56]研究发现，温度对拟穴青 蟹（Scylla paramamosain）循环养殖水体中微生物群落多样性有显著影响，在养殖系统水温 为 26 ℃时，水体中微生物多样性最高，其中，假单胞菌属、不动杆菌属（Acinetobacter） 和副球菌属等脱氮除磷菌属的相对丰度显著高于其他 4 组，而水温过高和过低都会降低水体 中微生物多样性。秦宇等[57]通过研究溶解氧及曝停比对单级自养脱氮系统微生物群落结构 的影响发现，较高溶解氧水平会对厌氧菌的代谢产生抑制，而低溶解氧水平将影响好氧菌的 活性。Downing 等[58]研究证实，当溶解氧质量浓度低于 0.2 mg/L 时，硝化细菌几乎没有活 性，硝化反应完全停止。pH 对于硝化细菌的生长影响较大，如亚硝化单胞菌在 pH 7.9～8.2 的环境中生长最快，硝化杆菌则是在 pH 7.2～7.6 的环境中生长最快[59]。王新为等[60]通过人 工调节液体培养基的 pH，检测氨氮和亚硝态氮转化率后发现，氨氧化细菌对碱性环境要求 较高，液体培养基若存在于较高 pH 的环境下，则有利于促进氨氧化细菌氧化氨氮。侯婷婷 [61]通过皮尔森相关性，探究健康红鳍东方鲀和健康青石斑鱼循环水养殖系统水体细菌 α-多 样性与环境因子（温度、氨氮、亚硝态氮、硝态氮以及化学需氧量）之间的关系，表明养殖 水体中细菌进化树分枝距离和 Shannon 指数均与温度和硝态氮之间存在高相关性（r≥0.49， P<0.05），与化学需氧量存在较高相关关系（r≥0.43，P<0.05）。进一步研究表明，温度、硝态氮和化学需氧量的升高与疣微菌科、红杆菌科、交替单胞菌科、蟑螂杆状体科、海洋螺 菌科等丰度变化一致。而这些细菌类群在海洋有机物和溶解性无机氮的降解中扮演者重要角 色[62-64]。 6 循环水养殖系统技术发展趋势 我国循环水养殖起步较晚，在 20 世纪 80 年代，我国开始重视发展循环水养殖，主要采 用直接从国外购买设备和技术的方式，但由于设备的运行和维护成本较高，且缺乏相关专业 人才，导致设备出现故障并被遗弃[65]。此后，循环水养殖技术在我国经过不断探索逐渐发 展，20 世纪 90 年代起，大菱鲆（Scophthalmus maximu）的工厂化流水养殖模式的成功运行 使得海水工厂化养殖开始在全国得到推广，极大带动了我国工厂化循环水养殖发展[66]。但 与淡水循环水养殖相比，海水循环水养殖存在较多的技术难题，突出表现在水电等资源大量 消耗浪费使得养殖成本过高，严重限制了海水循环水养殖产业的发展。近十年来，在国家相 关部门的支持下，相继启动了一系列“863”和科技支撑计划项目，并积极借鉴国际先进技术， 自主研发了一批适合我国国情的海水循环水养殖设施与装备，如微滤机、臭氧发生器、蛋白 分离器等[67-70]，并逐步完善了养殖技术和工艺海水循环水养殖技术，先后在对虾、鱼类和鲍 等多品种经济类水产动物养殖中应用[71-79]。据不完全统计，2019 年，全国示范和推广工厂 化海水循环水养殖面积超过 300 万 m2。我国近几年循环式工厂化水产养殖技术研究进展见 表 3。


7 循环水养殖系统展望及建议 高度严格的环境质量标准体系和水产养殖许可制度和高昂的人工费用，使得欧美发达国 家水产养殖技术高度集约化、智能化和环保。目前，欧洲和美国绝大多数水产养殖企业的苗 种孵化和培育均采用的循环水养殖系统，广泛用于大菱鲆[80]、鲑鳟鱼[81]、罗非鱼（Oreochromis） 养殖[82]。而日本，也开始将其用于鱼类、虾蟹和贝类工业化养殖，且技术成熟稳定[83]。 随着核心技术和水处理工艺成熟化，我国循环式工厂化养殖模式得到迅速发展，但是与 国外先进养殖技术相比，无论在功能性微生物的基础性研究还是循环水设备技术工艺方面还 存在较大差距。具体表现为：（1）我国循环水养殖仍简单沿用传统养殖技术，设备系统工 艺技术和生态环境构建技术还未形成，相关领域专家极其稀缺，造成设备系统运行效率低下 和成本过高；（2）海水生物净化系统的效率低，净化设施体量过大，且水质稳定性差，导 致养殖经济效益大打折扣；（3）相关配套技术依然落后，如动物营养与饲料学研究、水生 生态学研究、微生物学、水产动物生理学等领域基础研究需要加强。 由于微生物在循环水养殖系统中生物净化中的核心作用，因此微生物形成的生物滤膜直 接决定循环水养殖系统生物过滤效率。在实际应用中，为了更好发挥微生物作用，笔者认为， 首先要缩短挂膜时间，通常生物膜形成时间经常多达 1～2 个月，对于工业化养殖显然耗时 过长，且资源浪费严重，极大限制生物过滤效率。因此，一方面加强功能性菌种筛选工作， 优选出适应性强、繁殖快速、转化效率高的菌株加以定向培养和应用，一方面在过滤器生物 膜的接种上选取对数生长期菌种，并添加有机物、氮、磷等营养液，加速生物膜挂膜过程； 其次，重视生物群落平衡建立，由于生物膜的形成具有明显空间和时间分布，一个运行良好 的循环水养殖系统一定具备稳定且平衡的生物群落。因此，在菌落培养初期，可以添加一定 比例的混合菌液，迅速建立生物群落，优化功能性菌群比例，提高生物滤器净化效率。 在未来一段时间内，工厂化循环水养殖的综合成本不会有根本性的降低，但该类养殖方 式又是当今国际先进养殖模式的主流，并承担了一定的社会责任。可以通过关键技术引进与 创新，借鉴基础研究方法，促进我国工厂化循环水养殖应用基础研究水平的提高，着重掌握 技术关键，突破海水循环水养殖生物净化技术。此外，参考国外先进水质在线监控技术和养 殖系统自控技术，提高生产自动化水平，实现养殖精准生产的数据信息采集处理、诊断决策、 过程设计和控制。未来社会工业化的发展趋势以及世界先进养殖模式的发展水平预示，工厂 化循环水养殖系统将是未来水产养殖的重要模式。相信不久的将来，在国家政府的政策指引 下，在科研工作者的努力下，我国工业化循环水养殖产业一定能赶超发达国家，把我们水产 养殖大国打造成水产养殖强国。