由黑曲霉 Ｙ３（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ Ｙ３）形成的菌丝球经过生物絮凝剂改性强化后作为生物载体固定好氧 反硝化菌 Ｔ１３ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｔ１３），对其固定前后对全氮的去除效能、菌群的活性进行研究并分析固定化对于生 物强化脱氮效果的影响。 结果表明，菌丝球负载 Ｔ１３ 后去除全氮效能得到了明显的提高。 当改性菌丝球（湿质量） 与 Ｔ１３ 菌液（３．５×１０８ ＣＦＵ／ ｍｌ）的质量体积比 为１ ∶ １５ 时，去除全氮的效能最好。 改性菌丝球负载 Ｔ１３ 后的表观图 像和电镜扫描图像（ＳＥＭ）显示，Ｔ１３ 细菌附着在改性菌丝球的表面，且改性菌丝球载体的结构可以连续培养 ４５ ｄ 后仍保持紧实结构。 傅里叶红外光谱（ＦＴＩＲ）和三维荧光光谱（ＥＥＭ）结果显示，胞外聚合物（ＥＰＳ）在改性菌丝球固 定 Ｔ１３ 的过程中起到了关键作用。 菌丝球的菌丝缠绕形成的结构提供了强有力的机械结构，且具有较大的比表面 积和良好的传质性能，改性菌丝球可以作为良好的生物载体用于生物强化。 

 

关键词：

 改性菌丝球； 强化脱氮； 好氧反硝化菌； 生物载体

 

       生物强化技术在污水处理技术应用的过程中具 有独特的优势，如缩短生化系统的启动周期、提高污 染物的去除效率、减少剩余污泥产量等 。 生物强 化脱氮也是污水处理提标改造过程中一项重要的生 物强化技术，且研究者已经在国内外进行了较为广 泛的研究。 生物强化脱氮技术在污水处理系统中利 用具有特定脱氮功能微生物的特性，投加功能性微 生物菌剂，增加其生物量并提高其功能性活性，加上 调整工艺运行手段来达到改善脱氮效能的目的，提 高了氮素的脱除效果，从而促进出水水质的达标排 放 。 但是在投加功能性生物菌剂时，仍会面临功 能性菌种流失的问题，导致系统强化不够理想。 在生物强化技术应用的过程中，投加合适的载 体使功能性微生物附着其上，得以繁殖并维持其活 性是解决菌种流失的有效手段 。 载体固定化技 术不仅可以有效阻止功能菌种的流失，还使得生化 系统的固液分离更加简便，从而提高生化系统的可 操作性。 固定化载体材料的选择是固定化技术应用 的关键所在，合适的材料应当能为功能性微生物提 供良好的附着性能并为微生物的生长繁殖提供适宜 的场所。 在以往的研究中，多种固定化材料被尝试 用于脱氮细菌的固定化，如聚乙烯醇 、 海藻酸 钠 、聚氨酯泡沫 等。 在有载体的情况下，功能 性微生物固定在载体上的生长速率虽然没有游离状 态下（未固定在载体上）的高，但是其对底物的摄取 速率要明显高于游离状态 。 目前，也有一些学者 对新型生物载体（如生物质炭）展开研究，以期降低 载体的成本和提高生物强化的性能 ，新型的生物 载体对环境也更加友好。 菌丝球是霉菌浸没式生长过程中在特定水力剪 切力条件下自发缠绕成球形成的颗粒，其作为吸附 重金属离子、染料等难降解有机物的材料已获得较 为广泛的应用 。 菌丝球由于其所具备的沉降速 率快、易于固液分离、培养简便和对环境友好等特 点，被越来越多的学者在研究中尝试用作一种新型 的生物载体。 Ｚｈａｎｇ 等 将苯胺降解菌（ Ａｃｉｎｅｔｏ⁃ ｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ ＪＨ⁃９）、化学需氧量（ＣＯＤ）快速降 解菌与黑曲霉 Ｙ３ 形成的菌丝球混合培养后制成的 改性菌丝球颗粒用于序批式反应器 （ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂａｔｃｈ ｒｅａｃｔｏｒ， ＳＢＲ）运行，对苯胺的降解速率起到了 一定的促进作用。 Ｗａｎｇ 等［１２］ 利用黑曲霉 Ｙ３ 形成 的菌丝球将产絮菌 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｆ２ 和 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｉｃｕｓ Ｆ６ 固定后采用半连续发酵的方式 持续产絮 ３５ 个周期，直至改性菌丝球颗粒破碎。 Ｚｈａｏ 等 利用黑曲霉 Ｙ３ 形成的菌丝球固定产氢 细菌 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． Ｔ２ 进行产氢效能的研究，结果 表明，经过菌丝球载体固定的产氢细菌的累积产氢 量随着菌丝球载体的加入量增加而增加。 此外，菌 丝球作为生物载体也被广泛应用于产能微藻的培养 和富集 ，但是其作为载体在实际废水处理中的应 用还需要进一步研究。 本研究将黑曲霉 Ｙ３ 形成的菌丝球作为生物载 体用于固定好氧反硝化菌 Ｔ１３，对其固定前后对全 氮的去除效能、菌群的活性进行研究并分析固定化 对于生物强化脱氮效果的影响。 此外，对胞外聚合 物（ＥＰＳ）的变化和固定前后的扫描电镜图像（ＳＥＭ） 进行表征。 

１ 材料与方法 

１．１ 菌丝球和好氧反硝化菌的培养

       菌丝球的培养使用本课题组筛选的黑曲霉 Ｙ３ 作为菌种 。 培养时采用孢子悬浮液作为接种液。 将无菌去离子水加入长有黑曲霉 Ｙ３ 并生成了孢子 的固体培养基之上，用经消毒的接种环轻轻将孢子 刮下制成孢子悬浮液。 将孢子悬浮液装入经灭菌的 装有数粒玻璃珠的三角瓶内，加入适量的无菌去离 子水使孢子悬浮液稀释到一定浓度，旋转振荡 ２４ ｈ 使孢子悬浮液充分混匀分散后在 ６２０ ｎｍ 波长下测 量其吸光度 ＯＤ６２０ 。 使用孢子悬浮液时的接种量可 用下列公式进行计算： 

                        孢子悬浮液接种量 ＝ （０．２５×０．１％×液体培养基 体积） ／ 孢子悬浮液吸光度 

        菌丝球的培养采用张斯的方法。 菌丝球的 液体 培 养 基 成 分 为： 蔗 糖 １０. ０ ｇ， ＮＨ４Ｃｌ １. ０ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４·３Ｈ２Ｏ １. ０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０. ５ｇ，去离子 水１ ０００ ｍｌ。 按计算后的接种量接种后，在 ２８ ℃１４０ ｒ／ ｍｉｎ 条件下培养４８～７２ ｈ。

         好氧反硝化菌 Ｔ１３ 的菌种由本课题组筛选 。 菌种经发酵培养后的菌液在８ ０００ ｒ／ ｍｉｎ条件下离心 ５ ｍｉｎ 后弃置上清液，将沉淀的菌体使用 ２０ ｍｍｏｌ的 磷酸缓冲液清洗 ２ 次后，使用漩涡振荡器重新悬浮 并充分混匀。 制成的 Ｔ１３ 菌种悬液的含量约为３．５× １０８ ＣＦＵ／ ｍｌ。 

１．２ 生物絮凝剂的制备 

        生物絮凝剂的制备采用产絮细菌 Ｆ２ 。 将活 化后的絮凝菌 Ｆ２ 的菌液按 ５％的接种量接种到发 酵培养基中发酵培养 ２４ ｈ 后，按３ ∶ １ 的体积比加入 无水乙醇使生物絮凝剂析出，弃去无水乙醇，将絮凝 剂置入透析袋中，在去离子水中除去乙醇后冻干备 用。 生物絮凝剂发酵培养基的成分为葡萄糖 １０. ０ ｇ， Ｋ２ＨＰＯ４ ５. ０ ｇ， ＫＨ２ＰＯ４ ２. ０ ｇ， ＮａＣｌ ０. １ ｇ， ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０. ２ ｇ，尿素 ０. ５ ｇ，酵母膏 ０. ５ ｇ，去离 子水１ ０００ ｍｌ，ｐＨ ７. ２～ ７. ５，在 １１２ ℃ 、３０ ｍｉｎ 条件 下灭菌。

 １．３ 改性菌丝球的制备 

         称取湿质量为 ３０ ｇ 的菌丝球放入 ２００ ｍｌ、０. ２ ｇ ／ Ｌ的生物絮凝剂溶液中，在磁力搅拌器 ３０ ｒ／ ｍｉｎ的 搅拌转速下浸泡 １２ ｈ，使菌丝球与生物絮凝剂充分 接触后捞出，与 ３０ ｍｌ 的 Ｔ１３ 菌种悬浮液混合，在 １４０ ｒ／ ｍｉｎ、３０ ℃下振荡培养 ２４ ｈ。 

１．４ 多糖和蛋白质的提取及测定方法 

         多糖和蛋白质经加热后提取 。 取 ２５ ｍｌ 充 分混匀的样品置入离心管内，在１１ ０００ ｇ、４ ℃ 条件 下离心 １５ ｍｉｎ，弃置上清液，加入 ０. ０１％的 ＮａＣｌ 溶 液并定容至 ２５ ｍｌ，使用漩涡振荡器将离心的沉淀重 新完全混匀。 将混匀后的样品在 ８０ ℃ 水浴条件下 加热 ３０ ｍｉｎ，冷却至室温后再次在上述条件下离心。 离心后，将上清液经 ０. ４５ μｍ 膜过滤后待测。 

         蛋白质的测定方法采用福林酚法 。 取 １ ｍｌ 样品与 ５ ｍｌ 试剂Ⅰ充分混合后静置 １０ ｍｉｎ，然后加 入 ０. ５ ｍｌ 试剂Ⅱ并立即混合，继续在室温下静置 ３０ ｍｉｎ 后，使用紫外分光光度计在 ５００ ｎｍ 波长下测量 吸光度。 试剂Ⅰ的成分为溶液 Ａ 与溶液 Ｂ 按５０ ∶ １ 的体积比混合，其中溶液 Ａ 的成分为 Ｎａ２ＣＯ３ １０. ００ ｇ、ＮａＯＨ ２. ００ ｇ、ＫＮａＣ２Ｈ２Ｏ４·４Ｈ２Ｏ ０. ２５ ｇ，定容至 ５００ ｍｌ，溶液 Ｂ 的成分为 ０. ５ ｇ ＣｕＳＯ４ ，定容至 １００ ｍｌ。 试剂Ⅱ为福林酚试剂。 多糖的测定方法采用苯酚⁃硫酸法 。 取 １ ｍｌ 待测样品装入 １０ ｍｌ 的离心管中，再加入 １ ｍｌ 去离 子水和 １ ｍｌ ６％的苯酚并摇匀，然后快速加入 ５ ｍｌ 硫酸（９８％，质量分数），静置 １０ ｍｉｎ 并充分混合，继 续静置 ２０ ｍｉｎ 并冷却至室温后，使用紫外分光光度 计在波长 ４９０ ｎｍ 处测量其吸光度。 

１．５ 脱氢酶活性的测定方法

        脱氢酶活性的测定采用 ＴＴＣ（２，３，５⁃三苯基氯 化四氮唑） 法［２１］ 。 取 ５. ０ ｍｌ 上清液样品加入 ５. ０ ｍｌ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ 溶液（ｐＨ ＝ ８. ４），再依次加入 ５. ０ ｍｌ 去 离子水和 １０. ０ ｍｌ ４％的 ＴＴＣ 溶液。 同时，在对照组 中加入 ０. ５ ｍｌ 的甲醇。 将样品组和对照组用水浴 锅在 ３７ ℃条件下水浴加热 ３０ ｍｉｎ。 加热结束后，在 样品组和对照组中同时加入 ５. ０ ｍｌ 三氯甲烷，密封 后振荡 １０ ｍｉｎ，萃取反应生成的 ＴＦ（１，３，５⁃三苯基 甲臜）。 萃取结束后在３ ０００ ｒ／ ｍｉｎ下离心 ５ ｍｉｎ，离 心结束后取下层三氯甲烷溶液在波长 ４８５ ｎｍ 下测 量吸光度。 在测定菌丝球载体颗粒上的脱氢酶活性 时，将样品摇匀并取 ５. ０ ｍｌ 的悬浮液，静置沉淀后 将上清液弃置，再加入去离子水并定容至相同体积， 后续步骤同上。 

１．６ 傅里叶红外光谱（ＦＴＩＲ）样品的预处理及检测

         菌丝球载体固定好氧反硝化菌 Ｔ１３ 前后的 ＦＴ⁃ ＩＲ 样品预处理及测定步骤如下：将菌丝球载体样品 冻干后与溴化钾（ＫＢｒ）按１ ∶ １００（质量比）混合并压 缩，制成样品后使用 Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｎｅ Ｂ 傅 里叶变换光谱仪进行光谱测量。 

１．７ 三维荧光光谱（ＥＥＭ）样品的检测

         三维荧光光谱使用日本 Ｊａｓｃｏ 的 ＦＰ６５００ 荧光 光谱仪进行测量，发射波长为２２０～ ５００ ｎｍ，波长扫 描间隔为 ５ ｎｍ，吸收波长在２２０～ ６００ ｎｍ 内检测，步 进为 １ ｎｍ。 测量速率设置为２ ０００ ｎｍ ／ ｍｉｎ。 

１．８ 电镜扫描图像（ＳＥＭ）样品的预处理及检测

        将样 品 置 于 使 用 ０. １ ｍｏｌ ／ Ｌ 的 磷 酸 缓 冲 液 （ｐＨ ＝ ７. ４）配制的 ４％戊二醛溶液中，在 ４ ℃ 下浸泡 １ ｈ，对颗粒表面的菌体进行固定，固定后使用相同 的缓冲液清洗 ３ 次。 将样品依次在 ５０％、７０％、８０％ 和 ９０％的乙醇溶液中浸泡 １５ ｍｉｎ 进行脱水，最后再 在无水乙醇中浸泡 １５ ｍｉｎ。 脱水后的样品置于干燥 器中保存待测。 测量前，将脱水样品表面进行喷金 处理再上机检测。

２ 结果与分析 

２．１ 改性菌丝球负载 Ｔ１３ 对全氮的去除效能 

       将改性菌丝球（湿质量） 与 Ｔ１３ 菌液按１ ∶ ３０、 １ ∶ １５、１ ∶ １０、１ ∶ ６ 的质量体积比分别负载后进行 全氮去除效能的试验，以未添加改性菌丝球的 Ｔ１３ 菌液为对照。 并在相同负载比例下与未经生物絮凝 剂强化的菌丝球负载 Ｔ１３ 进行全氮去除效能的对 比，结果如图 １ 所示。 从图 １ａ 中可以看出，培养至 １３ ｄ 时，未经生物絮凝剂强化的菌丝球负载 Ｔ１３ 后 可较为明显地提升对全氮的去除效能，１ ∶ １５、１ ∶ １０ 和１ ∶ ６ 负载比例下的全氮去除率分别为 ４３. ０９％、 ４０. ９０％和 ４０. ９１％，而 Ｔ１３ 菌液（对照组）的全氮去 除率仅为 ２６. ０９％。 图 １ｂ 中经过生物絮凝剂改性强 化后的菌丝球负载 Ｔ１３ 后的全氮去除效能有了更为 明显的提升，培养至 １３ ｄ 时，１ ∶ １５、１ ∶ １０ 和１ ∶ ６ 负载比例下的全氮去除率分别为 ５２. １０％、４９. ３６％ 和 ５０. ２６％。 其中，以１ ∶ １５ 负载比例的菌丝球负载 Ｔ１３ 后的全氮去除率最为稳定。

        不同负载比例条件下生物絮凝剂改性菌丝球负 载 Ｔ１３ 对去除全氮效能的影响如表 １ 所示。 由图 １ 和表 １ 可见，在没有菌丝球作载体的情况下，尽管加 入了生物絮凝剂，但游离的 Ｔ１３ 菌液对全氮的去除 效能与未添加生物絮凝剂的差异并不显著 （Ｐ＞ ０. ０５），表明添加生物絮凝剂与否对 Ｔ１３ 游离菌去 除效能没有显著影响。 而在生物絮凝剂改性菌丝球 负载 Ｔ１３ 之后，全氮的去除效能与未经生物絮凝剂 改性的菌丝球相比，差异显著（Ｐ＜ ０. ０５）。 结果表 明，在有生物絮凝剂改性强化的情况下，菌丝球负载 Ｔ１３ 去除全氮的效能有显著提高，从经济适用的角 度出发，菌丝球的负载比例为１ ∶ １５ 较为合适，在满 足全氮去除效能提升的前提下，无需更多菌丝球载 体的加入。

２．２ 改性菌丝球负载 Ｔ１３ 的脱氢酶活性变化

        由图 ２ 可见，经过和未经过生物絮凝剂改性强 化的样品中，其上清液中脱氢酶活性随着培养时间 的延长呈现急剧下降的趋势，而菌丝球载体颗粒上 的脱氢酶活性则表现出持续上升的趋势。 在 Ｔ１３ 固 定后培养初期，液体培养基中存有大量的游离 Ｔ１３ 细菌，在每天更换 ５０％培养基时，会随着弃置的液 体流失部分菌体，因此上清液中的脱氢酶活性也随 之降低。 而颗粒上的菌量随着培养时间的延长则在 不断增加，因此颗粒上的脱氢酶活性在逐渐升高。

        对比图 ２ａ、图 ２ｃ，可以看出，生物絮凝剂改性与否对 菌丝球负载 Ｔ１３ 后上清液中的脱氢酶活性影响较 小，当负载比例为１ ∶ １５ 时，生物絮凝剂改性的菌丝 球比未经改性的菌丝球负载 Ｔ１３ 后在连续培养第 １３ ｄ 时的上清液脱氢酶活性高 ２. ５５ ｍｇ ／ ｇ。 而对比 图 ２ｂ、图 ２ｄ 可以看出，培养第 １３ ｄ 时，负载比例为 １ ∶ １５ 时生物絮凝剂改性的菌丝球比未经改性的菌 丝球负载 Ｔ１３ 后的脱氢酶活性高了 ７. ５１ ｍｇ ／ ｇ，提 高幅度约 ６２. ３％。 由于脱氢酶活性的强弱代表了 Ｔ１３ 活性的强弱和菌量的大小，因此这一结果证明， 菌丝球的改性与否对上清液中 Ｔ１３ 的活性和菌量没 有显著影响，而改性后的菌丝球使 Ｔ１３ 的固定化效 果得到了较为显著的提升。

２．３ 改性菌丝球负载 Ｔ１３ 后蛋白质和多糖含量的 变化趋势

        由图 ３ 可知，蛋白质的含量在培养前 ７ ｄ 里呈 现出下降的趋势，然后在后续的 ６ ｄ 内又呈现出了 上升的趋势，负载比例为１ ∶ １５、１ ∶ １０ 和１ ∶ ６ 的 改性菌丝球负载 Ｔ１３ 后的蛋白质含量在培养第 １３ ｄ 时分别达到了 ５９. ９３ ｍｇ ／ ｇ、６５. ２３ ｍｇ ／ ｇ和 ５８. ５５ ｍｇ ／ ｇ。 前 ７ ｄ 的培养过程中，有部分菌体随着更换 培养基时弃置的液体流失，因此蛋白质含量均降 低，而在后 ６ ｄ 的培养过程中，随着固定在改性菌 丝球载体上的 Ｔ１３ 生长繁殖，蛋白质含量升高。 多糖的含量在 １３ ｄ 的培养过程中变化不是十分明 显，总体呈现出较为平缓的趋势，到培养第 １３ ｄ 时 除１ ∶ １５ 比例下的多糖含量比培养第 １ ｄ 升高了 ３. ２１％外，１ ∶ ３０、１ ∶ １０、１ ∶ ６ 和对照组中的多糖 含 量 分 别 下 降 了 ４. ９５％、 ２８. ８１％、 ３９. ８４％ 和 ２１. ８５％。 负载比例为１ ∶ １５ 时多糖和蛋白质含量 随时间变化的影响如表 ２ 所示，可以看出，培养至 第 １３ ｄ 时，蛋白质含量相比于培养初始时有了显 著降低，而多糖的含量在培养第４ ～ ７ ｄ 时稍有上 升，至培养第 １３ ｄ 后又恢复了初始水平。 这是由 于作为载体核心菌丝球，其细胞壁主要组成中含 有较大量的多糖 ，且改性菌丝球负载 Ｔ１３ 的活 性颗粒的多糖成分的主要来源是菌丝球。 同时， 培养过程中的培养基成分 ｐＨ 始终保持在６. ８ ～ ７. ０，而制备菌丝球的黑曲霉 Ｙ３ 并不适宜在这种 环境下生长 ，因此，菌丝球在这样的共培养条 件下仅作为生物载体且生长速率极其缓慢。 另 外，菌丝球载体的结构在培养过程中可能也有少 许破损脱落，因此多糖的含量有少许的降低。

２．４ 改性菌丝球负载 Ｔ１３ 后傅里叶红外（ＦＴＩＲ）光 谱的变化

         菌丝球和改性菌丝球负载 Ｔ１３ 后的 ＦＴＩＲ 光谱 如图 ４ 所示，识别出的主要吸收峰如表 ３ 所示。 两 者的 ＦＴＩＲ 光谱吸收曲线大致相似，但在改性菌丝 球负载 Ｔ１３ 后，也有几处波数下的吸收峰发生了变 化。 光谱在３ ３２０ ｃｍ－１处的吸收峰较宽且深，是羟基 基团中 Ｏ－Ｈ 键的伸缩振动引起的，在２ ９２７ ｃｍ－１处 的锐峰是 Ｃ－Ｈ 键的伸缩振动引起的。 在１ １５４ ｃｍ－１ 处的吸收峰在改性菌丝球负载 Ｔ１３ 的曲线中变得更 加锐利，这是典型的多糖中－Ｏ－Ｃ－Ｏ 基团伸缩振动 引起的吸收峰，结合３ ３２０ ｃｍ－１处的宽峰，可以推断 出菌丝球中含有大量的多糖类物质。 在１ ６５５ ｃｍ－１ 处的吸收峰是 Ｃ ＝ Ｏ 和 Ｃ－Ｎ （酰胺Ⅰ带）的伸缩振 动引起的，１ ５４０ ｃｍ－１处的吸收峰则是 Ｃ－Ｎ 的伸缩 振动和 Ｎ－Ｈ 的形变振动（酰胺Ⅱ带） 引起的，这 ２ 处吸收峰是蛋白质二级结构特有的 ＦＴＩＲ 吸收峰， 并且在改性菌丝球负载 Ｔ１３ 的测定中吸收峰更加锐 利，表明蛋白质在改性菌丝球负载 Ｔ１３ 的过程中起 到了重要作用。 １ ４００ ｃｍ－１处的吸收峰是天冬氨酸 特有的去质子化的羧基中 Ｃ ＝ Ｏ 的对称振动引起的，且该吸收峰在改性菌丝球负载 Ｔ１３ 时显现得更 加明显，也表明蛋白质在菌丝球固定功能菌的过程 中起到了作用。 １ ０７５ ｃｍ－１处的吸收峰则是多糖中 Ｃ⁃Ｏ 的不对称伸缩振动引起的，８６６ ｃｍ－１ 、５４１ ｃｍ－１ 和 ５２８ ｃｍ－１处的吸收峰则表明在改性菌丝球中不饱 和键数量的增加。 有研究结果表明，羧基和胺基与 细菌附着固定在固体表面时的过程有关。

２．５ 改性菌丝球负载 Ｔ１３ 后 ＥＥＭ 的变化

        选择１ ∶ １５ 负载比例条件下的改性菌丝球，取 样后测定 ＥＥＭ 随培养时间延长的变化，结果如图 ５ 所示。 从图 ５ 中可以看出，样品的 ＥＥＭ 图包括了 ４ 个明显的峰。 第 １ 个主峰是激发／ 发射波长（ Ｅｘ ／ Ｅｍ ），位于 ２８０ ｎｍ ／ ３４０～３４５ ｎｍ 处的 Ａ 峰，第 ２ 个主 峰是 Ｅｘ ／ Ｅｍ ，位于 ２３０ ｎｍ ／ ３３０～ ３４０ ｎｍ 处的 Ｂ 峰。 据报道，这 ２ 个峰的荧光与蛋白质类物质的存在相 关，Ａ 峰所在的位置主要和芳香类、蛋白质类物质的 存在相关，Ｂ 峰位置则主要和色氨酸类、蛋白质类物 质相关 ，荧光的强度与物质的含量密切相关， 荧光的强度越高，则峰所在位置代表的物质含量越 高。 Ａ 峰和 Ｂ 峰的荧光强度在起初 ７ ｄ 的培养时间 里有略微的减弱，在后续 ７ ｄ 的培养过程中又有明 显的增强。 这一结果表明，在前 ７ ｄ 里，有部分的 Ｔ１３ 菌体还没有固定在改性菌丝球表面，随着置换 的培养基被一起排出体系，而在后续 ７ ｄ 的培养过 程中，随着固定在表面的菌体的生长繁殖，此类蛋白 质类化合物的数量也有升高。 第 ３ 个峰是 Ｅｘ ／ Ｅｍ ，位于３６５～ ３７０ ｎｍ ／ ４５０～ ４６０ ｎｍ 处的 Ｃ 峰，Ｃ 峰所在位置主要与类腐殖酸物质相 关。 第 ４ 个峰是 Ｅｘ ／ Ｅｍ ，位于２８０～ ２８５ ｎｍ ／ ４５０～ ４６０ ｎｍ 处的 Ｄ 峰，主要与类富里酸物质相关 。 对比 改性菌丝球负载 Ｔ１３ 第 １３ ｄ 时和第 １ ｄ 时的最大荧 光强度峰的位置，可以发现 Ｃ 峰和 Ｄ 峰有较为明显 的蓝移，Ｃ 峰从 Ｅｘ ／ Ｅｍ ＝ ３６０ ｎｍ ／ ４６６ ｎｍ 蓝移至 Ｅｘ ／ Ｅｍ ＝ ３６０ ｎｍ ／ ４４４ ｎｍ 处，Ｄ 峰则从 Ｅｘ ／ Ｅｍ ＝ ２８５ ｎｍ ／ ４６０ ｎｍ 蓝移至 Ｅｘ ／ Ｅｍ ＝ ２８５ ｎｍ ／ ４５５ ｎｍ 处。 荧光强 度最高峰的位置变化表明，ＥＰＳ 中的部分物质在共 培养过程中产生了变化，可能是由于 Ｔ１３ 的生长代 谢产生了新的代谢产物。

２．６ 改性菌丝球负载好氧反硝化菌 Ｔ１３ 的变化及 ＳＥＭ 图像 

      将改性菌丝球负载 Ｔ１３ 后连续培养 ４５ ｄ，每天 取出培养瓶静置沉淀后拍摄图像。 如图 ６ 所示，改 性菌丝球负载好氧反硝化菌 Ｔ１３ 后的变化较为明 显。 图 ６ａ 所示为培养 ２４ ｈ 后的菌丝球在未经生物絮凝剂改性时的情况，图 ６ｂ 所示为经过生物絮凝剂 改性后的菌丝球负载 Ｔ１３ 培养第 ４ ｄ 时的情况，可 见颗粒已经由白色变为浅黄色。 经过 １５ ｄ 的培养 后，颗粒颜色逐渐加深，且有少量浑浊出现，这是由 于改性菌丝球表面的 Ｔ１３ 生长繁殖后，菌量变大而 进入培养基中，也有少量断裂的菌丝携带附着的 Ｔ１３ 从菌丝球表面剥落所致。 连续培养至第 ４５ ｄ 时，改性菌丝球颗粒仍能保持完整的结构，颗粒直径 相比于纯菌丝球有略微的增大，但颗粒的颜色已经 由浅黄色变为黄褐色，且培养基中有大量的黄褐色 絮体，结合 ２．２ 节中得出的脱氢酶活性随培养时间 延长而提升，表明在改性菌丝球颗粒培养的过程中， Ｔ１３ 的菌量有明显的提升，不仅在改性菌丝球颗粒 的表面附着生长，且进入液体培养基的游离菌体能 够形成具有活性的絮体。改性菌丝球负载 Ｔ１３ 的 ＳＥＭ 图像也可以表明 菌丝球固定 Ｔ１３ 强化后的效果。 由图 ７ａ、图 ７ ｂ 可 以清晰看出，改性菌丝球表面负载了大量的 Ｔ１３ 细 菌，能够维持较为完整的颗粒状结构，横截面 ＳＥＭ 图像（图 ７ｃ、图 ７ ｄ）表明，

       改性菌丝球的内部是由菌 丝缠绕在一起形成的紧密网状结构，为颗粒的整体 提供了支撑，且能为改性菌丝球提供较大的比表面 积和良好的传质性能，使得 Ｔ１３ 细菌得以在改性菌 丝球表面附着生长。 黑曲霉 Ｙ３ 形成的菌丝球作为 生物载体也被用于固定产氢细菌 和产絮菌以 提高氢气和生物絮凝剂的产量，在这些研究中，产氢细菌和产絮菌也成功地固定在了菌丝球的表面。

３ 讨 论 

        菌丝球作为生物载体在以往的研究中被用于其 他一些功能微生物的固定，并用于强化污染物的去 除，Ｄｏｎｇ 等利用黄孢原平毛革菌 ＤＨ⁃１ 形成的菌 丝球负载光合细菌 ＰＳＢ⁃１Ｄ，用于强化 ２⁃氯酚的去 除，发现用同时培养法形成的混合菌丝球在 ７ ｄ 内 对 ２⁃氯酚的降解率可达 ８９％以上。 林胜红等 使 用烟曲霉形成的菌丝球固定另一株产漆酶的荧光假 单胞杆菌后处理刚果红废水，结果表明，被固定后的 混合菌丝球对废水的脱色效能和染料的降解效率都 有了明显提升。 在本研究中，菌丝球负载 Ｔ１３ 对全 氮的去除效能有较大的提升，在未经生物絮凝剂改 性强化的情况下，当负载比例为１ ∶ １５ 时，可使全氮 的去除率提升约 １７. ００％，而经过生物絮凝剂改性 强化后， 全氮的去除率在相同条件下又可提升 ９. ０１％。 生物固定强化技术主要目的在于提升体系 中功能微生物的生物量， 提高其在系统中的活 性 。 从脱氢酶活性的变化可以看出，Ｔ１３ 可以在 菌丝球的表面附着生长，菌丝球载体颗粒表面的脱 氢酶活性在逐渐升高，而在生物絮凝剂改性强化菌 丝球之后，仅培养 ７ ｄ 后，载体表面的脱氢酶活性就 有明显的提高，同时去除全氮的效能相比于游离菌也有较大改善，说明经过生物絮凝剂改性的菌丝球 可以强化好氧反硝化菌 Ｔ１３ 的固定，增强 Ｔ１３ 在体 系中的菌量和活性。 有研究结果表明，在微生物负载在载体表面的 过程中，ＥＰＳ 起到了重要作用。 王鑫等 用膨胀石 墨⁃海藻酸钙法固定石油菌 Ｔ４ 的过程中发现，Ｔ４ 附 着在载体表面的时候会分泌大量的 ＥＰＳ。 田秀梅 等采用乙酸改性苎麻纤维为载体吸附固定石油 降解菌时也发现，细菌自身产生的胞外聚合物增强 了对载体材料的黏附。 而在膜生物反应器的研究中 也发现，通过减少 ＥＰＳ 的产生可以有效预防微生物 群体附着在膜的表面，有效减少膜污染的发生 。 在本研究中，ＦＴＩＲ 的图谱分析结果表明，多个蛋白 质或多糖中含有的基团的吸收峰在改性菌丝球负载 Ｔ１３ 前后产生了变化。 而从 ＥＥＭ 分析结果中可以 看出，ＥＰＳ 的含量在 １３ ｄ 的培养中经历了先降低后 升高的过程，尽管在前 ７ ｄ 中被固定的 Ｔ１３ 菌量有 少许下降，但在后续的培养过程中其菌量和活性都 有所提高，这一结果表明，ＥＰＳ 在改性菌丝球负载 Ｔ１３ 的过程中起到了关键作用，特别是蛋白质，有助 于 Ｔ１３ 在菌丝球表面的固定。 改性菌丝球培养过程中的表观图像及 ＳＥＭ 图 像表明，改性菌丝球可以作为生物载体将好氧反硝 化菌 Ｔ１３ 有效固定在其表面。 经过 ４５ ｄ 的培养后， 改性菌丝球载体仍能保持完整、良好和紧实的结构， 菌丝缠绕形成的表面提供了较大的比表面积供细菌 附着，而 Ｔ１３ 菌体附着后也可以继续生长繁殖，且从 载体表面脱离下来的菌体也能够形成具有活性的絮 体，避免在固液分离的过程中被排出系统导致流失。

 

 

原标题：生物絮凝剂改性菌丝球负载好氧反硝化菌 Ｔ１３ 强化 脱氮

原作者：孔祥震   郭海娟   马 放    耿明月   肖 霄