以猪场废水中典型的抗生素抗性基因( antibiotic resistant genes, ARGs) 为研究对象,针对 MBR 工艺处理猪场废 水,研究生物处理过程抗性基因去除及其与工艺参数的关系。 膜生物反应器( membrane bio-reactor, MBR)小试装置对 猪场废水中 COD 和 TN 的平均去除率分别达到 95. 5%和 92. 4%。 在污泥龄( sludge retention time,30 d) 较长时,MBR 对 ARGs 的拷贝数去除率在 1. 5 ~ 2 logs,而将 SRT 缩短至 15 d 时 去 除 率 最 高 可 达 3. 78 logs。 环 境 因 子 ( DO、 pH、 Temp、SS、COD、NH+4 -N 和 TN)对 MBR 出水中 ARGs 拷贝数和丰度的影响呈现出相同趋势。 因此,通过降低 SRT、提高 DO、pH、和温度等措施,可以提高 ARGs 拷贝数和丰度的消减效率,具有实际应用价值和指导意义。

关键词:

       膜生物反应器;猪场废水;抗生素抗性基因;环境因子

 

0     引 言

       畜禽养殖业长期滥用抗生素造成的选择压力是 诱导细菌产生抗生素抗性的主要原因之一 。 抗生 素抗性基因( antibiotic resistant genes, ARGs) 可能随 养殖废弃物进入水体、土壤和大气,给环境安全和人 类健康带来潜在的巨大威胁,已经被定义为一种危险 的新型环境污染物。 国内外环保机构很少对环境 中的 ARGs 进行检测和评价,更没有对 ARGs 的排放 指标提出明确限定。 现阶段的研究集中于 ARGs 在土壤或自然水体中的赋存特性及迁转规律,对养殖废水生物处理过程中 ARGs 去除效果及影响因素的 研究尚不多见 。 畜禽养殖废水通常含有较高浓度 的 COD、NH+4 -N 和 SS,这些污染物的去除与 ARGs 削 减的关系值得深入探讨。 许多研究者认为生物量的 降低是 ARGs 在污水处理过程中得到削减的主要原 因,也有学 者 发 现 增 加 活 性 污 泥 的 有 机 负 荷、缩 短 SRT 会导致序批式活性污泥法处理过程中四环素抗 性基因拷贝数的增长,但对抗性基因的丰度却没有明 显影响。 大量调查发现,在不同生物处理工艺、 不同运行工况和条件下 ARGs 的去除效果存在较大 差异 ,但现阶段关于生物处理反应器运行参数对 ARGs 去除效果影响研究尚不多见。 本研 究 采 用 膜 生 物 反 应 器 ( membrane bio- reactor, MBR)处理某规模化养猪场废水,提取猪场 废水和 MBR 出水中的微生物总基因组 DNA 并采用 实时荧光定量( qPCR) ,检测样品中多种抗生素抗性 基因的拷 贝 数 和 丰 度, 探 究 MBR 污 泥 龄 ( SRT) 为 30,15 d 时,MBR 进水( Inf-1,Inf-2) 、出水( Eff-1,Eff- 2)样品中 ARGs、16Sr RNA、Ⅰ类整合子( intⅠ1) 拷贝 数的变化;通过 OUT 聚类及主成分分析( PCA) 研究 猪场废水处理过程中 ARGs 拷贝数和丰度变化规律; 通过冗余性分析(RDA)讨论 ARGs 的去除与 MBR 运 行过程中环境因子的相关性。 

1      实验部分

 1. 1 MBR 实验装置 

       实验室设置的 MBR 如图 1a 所示

            

       主体由有机玻 璃制成,有效容积为 5 L(D 12 cm×H 50 cm) ,室温运 行( 20 ~ 25℃ ) 。 MBR 中间安装垂直搅拌,下部安装 微孔曝气器(气体流量 1 ~ 2 L / min) ,反应器侧壁处安 装聚偏氟乙烯( PVDF) 中空纤维式微滤膜组件,平均 膜孔径为 0. 1 μm,膜面积为 0. 1 m2 ,膜通量为 10 ~ 20 L / (m2·h) 。 反应器和中空纤维膜组件实物图见 图 1b。MBR 采用缺氧 / 好氧交替运行方式,每个周期反 应器进水 0. 25 L,缺氧搅拌 3. 5 ~ 4. 5 h,好氧曝气 7 ~ 9 h,采用膜组件抽吸出水,水力停留时间( HRT) 为 8 ~ 10 d 。 

1. 2  实验水质与接种污泥 

        实验周期为 2018 年 4—8 月。 猪场废水取自四 川省绵阳市某规模化猪场,取回后储存于 4 ~ 6℃ 冷库 中,水质如表 1 所示。 MBR 接种污泥取自绵阳某城 市污水处理厂曝气池,ρ(MLSS)约为 5 g / L。

1. 3  理化指标测定

        废水水质指标测试方法按照标准方法测定;TN 采用元素分析仪测定(Elementar, USA) ;废水水质指 标测试方法按照标准方法测定;TN 采用元素分析仪 测定(Elementar, USA) ;NH+4 -N、NO-2 -N、NO-3 -N 采 用分 光 光 度 计 ( Shimadzu, Japan ) 测 定; COD 采 用 COD 测试管测定(HACH,USA) ;DO 采用通用数字控 制器直接读取( HACH,USA) ;pH 采用 pH 变送器直 接读取( TOA-HKK,Japan)  。

 1. 4 DNA 提取 

        DNA 提 取 采 用 FAST DNA 提 取 试 剂 盒 ( MP Biomedicals, USA) , 并 按 照 试 剂 盒 操 作 说 明 提 取 DNA。 所 提 DNA 通 过 1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 和 NanoDrop ND-1000 进行质检和浓度测定。 DNA 样品 保存在-80 ℃ 冰箱中。

1. 5  实时荧光定量 PCR( qPCR)分析

        采用实时荧光定量 PCR 对样品中抗生素抗性基 因、基因转移元件、细菌总量进行基因数量定量检测 分析,实时荧光定量结果即为 ARGs 拷贝数,相对丰 度( copies/ 16S rRNA copies ) 为 基 因 拷 贝 数 与 16S rRNA 基因拷贝数的比值。 按照不同抗性机制,每 种抗性机 制 选 择 1 ~ 2 种 进 行 测 定。 实 验 采 用 ABI real-time PCR system 7500( ABI,USA) 对基因进行测 定 ,所测基因序列采用通用序列 。 

1. 6  数据分析 

        污染物去除数据分析采用 Origin8. 5 绘制;针对 抗性基因与基因转移元件的相关性分析采用 SAS 软 件完成;针对各样品中 ARGs 拷贝数及丰度的主成分 分析 ( PCA ) 采 用 Canoco5. 0 绘 制 ( Microcomputer, USA) ;环境变量和 ARGs 含量的典型性分析( RDA) 使用 Canoco4. 5 完成。

 2     结果与讨论

 2. 1 常规污染物的去除效果 

        实验过程中 MBR 运行参数、进出水浓度如表 2、 表 3 所示。

           
        

        根据 SRT 将实验划分为 2 个阶段( 第 1 阶段 SRT = 30 d,第 2 阶段 SRT = 15 d) ,COD 和 TN 负 荷在两阶段保持相似。 由于 MBR 进水为实际猪场废 水,COD、NH+4 -N 和 TN 浓度存在一定波动。 2 个阶 段 COD 平均去除率分别为 94. 9% 和 95. 5%,NH+4 -N 平均去除率分别为 98. 3%和 97. 2%,以及 TN 平均去 除率为 92. 1%和 90. 7%,表明 MBR 在处理过程中可 以有效去除常规污染物。

2. 2   ARGs 拷贝数及丰度的削减

        MBR 进出水中 ARGS 拷贝数变化如图 2a 所示。

            

        可知: 实 验 采 用 的 猪 场 废 水 中 blaTEM、 tetM、 tetG、 tetX、sul1、sul2、 ermB、 ermF、mefA、 ereA 的 拷 贝 数 分 别 为 2. 29×105 ~ 8. 27×105 ,4. 47×107 ~ 1. 08×108 ,8. 25× 107 ~ 1. 84 × 108 , 9. 01 × 107 ~ 1. 35 × 108 , 1. 61 × 108 ~ 2. 85× 108 ,1. 76 × 106 ~ 2. 23 × 106 , 2. 58 × 107 ~ 4. 65 × 107 ,4. 79 × 107 ~ 1. 22 × 108 , 2. 19 × 106 ~ 1. 03 × 107 copies/ mL。 其中,大环内酯类抗性基因 ermB、ermF、 mefA、ereA 在养殖废水的拷贝数最高,其次是磺胺类 抗性基因 sul1、sul2 和四环素类抗性基因 tetM、tetG、 tetX。 冀秀玲等 调查了上海地区养猪场和养牛场 废水中磺胺类和四环素类抗性基因,含量最高的分别 为 sulA(108 ~ 1010 copies/ mL)和 tetW(106 ~ 107 copies/ mL) 。 泰乐菌素是除四环素类与磺胺类抗生素之外 应用最广泛的兽用抗生素,可能引起大环内脂类抗性 基因含量的提高,Chen 等对 3 家养猪场废水中大 环内脂抗性基因进行了定量检测,发现 ermB、ermF 的 拷贝数较高( 107 ~ 109 copies/ mL) ,ermX 则相对较低 (104 ~ 106 copies/ mL) ,与本实验结果基本一致。 值 得一提的是,β-内酰胺类抗生素是典型的人用抗生 素,而养殖废水却有 β-内酰胺类抗性基因 blaTEM 检 出,Tao 等 同样在养猪废水中检出 blaTEM。 MBR 处 理 的 出 水 中 blaTEM、 tetM、 tetG、 tetX、 sul1、 sul2、 ermB、ermF、mefA、ereA 的检出率为 100%。 为了进一步阐明 ARGs 在 MBR 中的赋存特性, 以 ARGs copies/ 16S rRNA copies 表示各种抗性基因 在 DNA 中的丰度 。 MBR 进出水样品中抗生素抗 性基因的丰度如图 2b 所示,进水中抗生素抗性基因 blaTEM、 tetM、 tetG、 tetX、 sul1、 sul2、 ermB、 ermF、 mefA、 ereA 的丰度分别为 8. 25×10-5 ~ 1. 07×10-4 ,1. 45×10-2 ~ 2. 88×10-2 ,1. 56×10-2 ~3. 72×10-2 ,1. 38×10-2 ~ 5. 47×10-2 ,2. 49×10 - 2 ~ 6. 44×10 - 2 ,5. 14×10 - 3 ~ 1. 37×10 - 2 ,2. 18× 10 - 4 ~ 8. 40×10 - 4 ,1. 77×10 - 2 ~ 2. 72×10 - 2 ,5. 76×10 - 3 ~ 4. 11×10 - 3 ,2. 45×10 - 4 ~ 3. 80×10 - 3 。 与文献报道的结 果相比, β-内 酰 胺 类 抗 性 基 因 blaTEM 远 低 于 Tao 等的监测结果(1. 35×10 - 3 ~ 3. 63×10 - 2 ) ;四环素类 抗性基因 tetM、tetG 则高于冀秀玲等的调查结果 (5. 87×10 - 7 、3. 55 × 10 - 2 ) ;其余抗生素抗性基因的丰 度基本与文献报道的一致。 MBR 对猪场废水中 ARGs 的拷贝数去除效果如 图 3a 所示。

             

       可知:MBR 对选定的 10 种 ARGs 的拷贝 数去除效果非常显著。 运行第 1 阶段( stage1,SRT = 30 d ) , 抗 性 基 因 tetM、 tetG、 tetX、 sul1、 sul2、 ermB、 ermF、ereA 拷贝数去除量均能达到 1. 5 ~ 2 log;而在运 行第 2 阶段( stage2,SRT = 15 d) ,通过控制排泥缩短 反应器 SRT,使得 MBR 对 ARGs 拷贝数的去除率显 著 提 高, blaTEM、 tetM、 tetG、 tetX、 sul1、 sul2、 ermB、 ermF、mefA、ereA 的去除量分别达到 1. 54,2. 07,3. 38, 2. 40,3. 78,3. 19,3. 08,2. 92,2. 29,2. 50 log。 MBR 对 抗生素抗性基因丰度的削减情况如图 3b 所示。 可 知:经过处理后,tetX、sul1、sul2、ermB 丰度有所降低, 但是 tetM、tetG 和 blaTEM 丰度有上升趋势,这是由于 MBR 在处理废水时并不能有效去除所有抗性基因, 其中一些难以去除的抗性基因对环境存在较大风险。 污水生物处理工艺并不能实现抗性基因完全去 除,出 水 中 的 ARGs 拷 贝 数 依 然 很 高。 Barkovskii 等将氧化塘处理养殖废水后四环素类抗性基因的 去除趋势归为 2 类:一类是丰度大幅降低甚至低于检 测限,包括 tetB、tetL、tetM;另一类是经处理后丰度不 变甚至有所提高,包括 tetG、tetO、tetW,可能因为这类 基因常位于转移原件上,在 MBR 中发生了基因的水 平转移。 针对抗性基因与基因转移元件的相关性,sulI 与 intI1 具 有 极 显 著 的 相 关 性 ( p < 0. 001; r2 = 0. 803) ,这可能由于 sulI 经常与一类整合子结合在一 起。 Roberts 等 指出 tetM 可能由转座子 Tn916- Tn1545 和结合质粒介导。 有研究表明,通常与小型 非接合型质粒或具有多重耐药性的质粒相结合的抗 性基因,更易于发生抗性基因的水平转移,其环境 排放会对水生生物和人类造成威胁,需要引起更为广 泛的重视。 目前,普遍认为生物处理工艺中抗生素抗 性基因丰度的升高,是由于抗生素抗性基因在生物量 丰富并存在选择性压力的活性污泥中发生了水平转 移,使得单位水体中更多的微生物获得抗生素抗性基 因 。 污水处理工艺对抗生素抗性基因丰度有一定 的削减或增加作用,但具体机理还需要进一步探讨。 基于各样品中 ARGs 拷贝数及丰度的主成分分 析如图 4 所示。 

              

        从样品的聚类结果可以看出:不同阶 段养殖废水中,ARGs 含量差异较大,这可能是养殖 场在不同季节、不同生产阶段产生的运营管理、饲料 使用状况存在较大差异 ;进水样品中含有较高丰 度的 mefA、tetX、tetG、sul1、sul2 等,而出水样品中含有 较高 丰 度 的 blaTEM、 ermF、 intI1、 ereA、 ISRC1、 ermB、 tetG、sul1、 sul2。 第 2 阶段出水 ( 样 品 Eff2-1、Eff2-2、 Eff2-3)与第 1 阶段出水( 样品 Eff1-1、Eff1-2、Eff1-3)以 及 进 水 样 品 存 在 较 大 差 异, 具 有 更 高 丰 度 的 blaTEM、ermF、intI1、ereA、ISRC1。

2. 3  ARGs 去除的影响因素

        为了阐明 MBR 不同运行工况下对 ARGs 拷贝数 的去除效果,采用冗余分析明确了 MBR 中 DO、 pH 值、温度( T) 和污泥浓度( MLSS) 等工艺参数对出水 中 COD、NH+4 -N、SS 与不同阶段 ARGs 的绝对去除量 关系的影响,如图 5 所示。 

                

        由图 5 可知:环境因子(DO、pH、T、SS、COD、NH+4 -N 和 TN)对 MBR 出水中 ARGs 拷贝数和丰度的影响呈 现出相同趋势。 反应器内 COD、SS 和 TN 的去除率 与养殖废水中抗生素抗性基因的拷贝数与丰度消减 呈正相关,因此当 SS、COD、NH+4 -N 及 TN 的去除率 增加时,在贫营养条件下,微生物的生长和水平转移 都受到抑制,抗生素抗性基因的拷贝数与丰度也随之 消减。 Ma 等指出 ARGs 去除与菌群结构具有相关性,主要表现在抗性基因的宿主菌群在不同环境 中的 变 化。 同 时, MBR 运 行 过 程 中 应 保 持 较 高 的 DO、pH、T。 此外,MBR 在较短的污泥龄( SRT = 15 d) 条件下运行,有利于所检测的大多数 ARGs 拷贝数和 丰度的消减。

 

3     结 论

       1)采用高通量测序方法检测样品中多种抗生素 抗性基 因 的 拷 贝 数 和 丰 度, MBR 对 猪 场 废 水 中 的 ARGs 具有显著的去除效果,主要表现在 ARGs 的拷 贝数降低,这种去除可能缘自对猪场废水中细菌的去 除;MBR 出水中 tetM、tetG 和 blaTEM 丰度有上升趋 势,这可能是由于在生物量丰富并存在选择性压力的 活性污泥中发生了 ARGs 的水平转移,造成抗生素抗 性基因丰度的升高。

       2) MBR 中 DO、pH、Temp 和 MLSS 等工艺参数, 出水中 COD、SS、NH+4 -N 和 TN 等污染物浓度与不同 阶段 ARGs 去 除 存 在 一 定 相 关 性, 较 短 的 污 泥 龄 ( SRT = 15 d)有利于所检测的大多数 ARGs 拷贝数削 减,T、DO、pH 升高则有利于抗性基因的削减。

       3)抗性基因在去除过程中效果存在差异,部分经过处理后丰度上升的抗性基因会对环境构成潜在 危害,而处理后丰度下降的抗性基因则对环境风险相 对较小。 因此,建议禽畜养殖企业在实际操作中,一 方面要尽量对养殖废水和养猪废物进行处理,同时应 推广所含抗性基因对环境风险较小的抗生素,最大程 度上减少产业的环境影响。

 

 

原标题：MBR 处理猪场废水过程中抗生素抗性基因的去除

原作者：段 彤   曾小芸    谈树成