作者：唐亚鹏1, 2 董世瑞3 田吉腾1 周 茜1, 2 王印庚1, 2 张天时1, 2① (1. 中国水产科学研究院黄海水产研究所 山东青岛 266071; 2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产 出过程功能实验室 山东青岛 266237; 3. 天津市食品生物技术重点实验室 天津商业大学生物技术与食品科学学院 天津 300134)

摘要 循环水养殖可有效减少病原体的入侵, 是我国水产养殖业发展的重要方向。为完善凡纳滨 对虾(Litopenaeus vannamei)循环水养殖系统, 采用生态调控、16S rRNA 高通量测序、宏基因组学分 析与数理统计等方法, 系统分析了对虾循环水养殖系统中水质指标变化与菌群结构和基因功能的关 系。结果显示, 养殖池水质指标包括温度、溶解氧、盐度、pH 以及氨氮 0.11~1.16 mg/L, 亚硝酸氮 0.10~0.66 mg/L, 硝酸氮 0.84~35.40 mg/L 均在安全范围内; 经过 63 d 养殖, 凡纳滨对虾平均体重达 到 11.78 g 左右, 产量为 3.28 kg/m3 左右, 存活率为 69.59%左右。菌群结构与功能分析结果显示: 在 开始运行期与水质变化平稳期生物滤池中菌群结构差异较大。在开始运行期海杆菌属(31.37%)占绝 对优势, 而在平稳期则以分枝杆菌属(6.65%)、分枝菌酸杆菌属(6.39%)、食烷菌属(5.21%)、海杆菌属 (3.36%)、中慢生根瘤菌属(2.30%)、红杆菌属(1.34%)、副球菌属(1.29%)等反硝化细菌和硝化杆菌属 (1.17%)占据优势。通过比对 KEGG 数据库发现涉及碳水化合物代谢和氨基酸代谢的蛋白数目最多, 说明异养反硝化菌需要利用多种碳源来执行反硝化功能。

关键词 循环水养殖; 凡纳滨对虾; 高通量测序; 宏基因组学; 菌群结构

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是世界范围 内最主要养殖的对虾品种。近年来, 随着养殖规模的 扩大及高密度养殖模式的发展, 病害、养殖环境恶化 及环境污染等问题困扰着对虾养殖业的进一步发展。 循环水养殖具有节电、节水、节地等优点, 并可有效 减少病原体的入侵, 是我国水产养殖业发展的重要 方向(臧维玲等, 2008; Holl et al, 2011; 王峰等, 2013; 黄志涛等, 2016; 张龙等, 2019; 洪越群等, 2019)。 循环水养殖系统的核心是通过硝化细菌将氨氮 或亚硝态氮转变成为毒性较小的硝态氮, 再通过反 硝化细菌将硝酸盐转化为气态氮(李秀辰等, 2010; Van Rijn, 2013; 刘文畅等, 2016; Qiu et al, 2016)。因 此, 形成有效的功能菌群是维持养殖水环境稳定的 重要前提。近年来, 开展了许多循环水系统中功能菌 群的研究(李秋芬等, 2011; 王威, 2012; Auffret et al, 2013)。但这些研究结果多关注菌群结构组成与水质 调节作用的关系, 对菌落中发挥主要作用的功能基 因的报道较少。 此外, 养殖环境与对虾疾病的发生有密切的关 系, 通过研究养殖环境中的微生物群落结构和多样 性以及它们与环境间的相互关系对控制虾病的发生 有重要意义。近年来, 已有较多有关对虾养殖水体中 微生物群落组成和养殖环境变化关系的报道(Johnson et al, 2008; Sakami et al, 2008)。其中 Tang 等(2014)比较了南美白对虾养殖池塘高水温(≥30 °C)和低水 温(≤20 °C)条件下的细菌群落组成, 发现放线菌门 (Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门 (Bacteroidetes)是高水温和低水温条件下丰度最高的 门, 且检测到大量未分类的细菌; 与低水温相比, 在 属和种水平上, 高水温样本中的细菌群落有更高的 丰富度和多样性, 同时发现了一些致病菌, 证明环境 因子温度是细菌群落的主要驱动因子。张皓(2015)开 展了凡纳滨对虾养殖池塘水体及底泥环境微生物群 落动态变化与水环境互作的研究, 探讨了养殖环境 中优势细菌、益生菌和潜在致病菌之间的互作和动态 变化关系, 证明水体中的氨氮(AN)、化学需氧量 (COD)、总氮(TN)对水体中细菌种群影响较大, 不同 种类微生物与水质指标相关性不同。 目前, 16S rRNA 高通量测序与宏基因组学测序 分析技术已成为表征微生物群落结构与功能的常规 方法(Tringe et al, 2005; Oh et al, 2011; Bai et al, 2014; Sunagawa et al, 2015; Mitchell et al, 2018; Taᶊ et al, 2021)。本文采用 16S rRNA 高通量测序与宏基因组学 分析等方法, 对凡纳滨对虾循环水养殖系统中生物 滤池内细菌群落结构和功能进行分析, 结合养殖过 程中养殖水体水质指标变化以及对虾生长状况, 为 了解生物滤池中微生物在对虾养殖水体水质调控中 发挥作用的机制提供基础资料。

1 材料与方法 1.1 材料 实验所用凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)虾 苗购自海南正大集团铺前镇种苗场, 在海阳市黄海 水产养殖有限公司进行室内循环水养殖实验, 养殖 时间 9~11 月, 实验共进行 63 d。

1.2 方法 1.2.1 循环水养殖设施和操作 养殖池为半地下 式温棚水泥池, 3 个水泥池(2#, 3#, 17#)大小均为 10 m×8 m×1.8 m, 养殖水深约 1 m。海水取自于砂滤 井, 采用同一循环水水质处理系统。 滤料池填料采用自然挂膜工艺培养生物膜 20 d, 之后将标粗后的虾苗分苗到循环水车间。在养殖前期 (30 d 以前)、中期(30~50 d)、后期(50 d 以后)的循环 量分别为 2、4、6~8 循环/d。在养殖过程中对生物滤 料池进行遮光处理。

1.2.2 日常管理与统计指标 对虾标粗后, 初始 放养密度为 500 尾/m2 , 每天排污 2~3 次。养殖前期 日投喂饲料 3~4 次, 养殖中后期日投喂 2~3 次。实验 结束时, 统计测量各池对虾产量及数量, 计算成活 率、生长率及饵料转化率。对虾生长性能测定参照张 龙等(2019)方法。

1.2.3 水质指标测定方法 每隔 7 d 使用 YIS6920 型多功能水质测定仪测定水温(T)、盐度(S)、溶解氧 (DO)、pH 值; 采用五点取样法采集水体表层以下约 30 cm 处水样 500 mL, 经过 0.22 μm 滤膜抽滤后的水 样, 用于氨氮、亚硝酸氮及硝酸氮质量浓度测定, 分 别采用《海洋调查规范》(GB/T 12763.4—2007)中的 靛酚蓝分光光度法、萘乙二胺分光光度法和锌镉还原 法测定。

1.2.4 菌群样本的采集 根据水质指标变化, 在 养殖第 0~7 d (开始运行期, 记作 Star)和第 45~52 d (水质指标变化平稳期, 记作 Stat), 每天取滤料池水 样通过 0.22 μm 滤膜抽滤得到细菌样本放于–80 °C 保 存, 用于 16S rRNA 高通量测序。

1.2.5 基因组 DNA 的提取和检测 将水样的滤膜 剪 碎 , 按照周敏等 (2018)的方法对菌群宏基因组 DNA 进行分离和纯化, 由上海派森诺生物科技股份 有限公司做宏基因组测序。

1.2.6 16S rRNA 测序分析 Star 样本进行 16S rRNA 高通量测序分析。基于 OTU 聚类的 Vsearch (Rognes et al, 2016)方法进行序列拼接, 质量过滤, 去重, 聚类。采用 QIIME2 的 classify-sklearn 算法 (Bokulich et al, 2018), 使用 Naive Bayes 分类器进行 注释。依据注释结果统计样本在各分类水平中含有的 分类单元数量。

1.2.7 宏基因组测序 对 Stat 样本进行宏基因组 测序分析。基于 Illumina HiSeq 4000 高通量测序平台 进行双端测序。使用 Megahit(vl.0.6)进行序列组装, 采用 MetaGeneMark (Zhu et al, 2010)进行基因预测。 KEGG 数据库进行基因功能注释。通过 BLASTN 比 对(E<0.001), 使用 MEGAN (Huson et al, 2011)软件中 的“最低共同祖先”算法(Huson et al, 2007), 将目标序 列进行物种注释分类, 获得样本在不同分类水平上 的丰度信息。

2 结果与分析 2.1 水质指标变化 在养殖实验过程中, 温度、溶解氧、盐度和 pH 动态变化如图 1 所示, 3 个养殖池常规水质变化趋势 基本一致, 其中, 温度变化范围为 23.0~29.4 °C, 均值(25.92±0.06) °C, 呈逐渐下降趋势, 随养殖时间的 延长气温逐渐下降造成水温降低, 后期使用锅炉加 热, 水温有所回升; 溶解氧变化范围为 5.4~6.8 mg/L, 均值(6.03±0.04) mg/L, 在养殖过程中溶解氧呈现出 波动变化, 可能与系统在内外循环、藻类增氧联合作 用有关(杨菁等, 2010); 盐度变化范围为 24.5~30.8, 均 值(27.92±0.05), 养殖后期盐度逐渐上升, 可能是由于 循环水养殖换水量少, 每次仅添加 10%的换水量, 水 分蒸发量大造成盐度升高; pH 变化范围为 7.5~8.2, 均 值(7.92±0.03), 呈逐渐减小的趋势, 这表明在养殖过 程中, 养殖生物量逐渐增大, 对虾呼吸作用加强以及 有机物质分解产生的 CO2 是 pH 减小的主要原因(陈剑 锋等, 2006)。综上所述, 本系统养殖环境符合凡纳滨对 虾培养基本要求, 适合凡纳滨对虾的生长(林继辉等, 2004; 沈丽琼等, 2007; 杨菁等, 2010)。 氨氮、亚硝酸氮及硝酸氮质量浓度变化如图 2 所 示, 循环水养殖水体氨氮浓度呈逐渐上升趋势, 亚硝 酸氮浓度呈先上升后下降的趋势, 其浓度变化范围 分别在 0.05~1.16 和 0.11~0.67 mg/L, 均值分别为 (0.59±0.07)和(0.31±0.01) mg/L。氨氮及亚硝酸氮主要 来源于残饵、粪便等有机物质的分解, 而且凡纳滨对 虾排泄作用也可产生氨氮(宋协法等, 2009)。刘健等 (2017)发现氨氮与亚硝酸氮质量浓度是凡纳滨对虾养 殖中后期的主要限制因子, 在密闭式养殖过程中具 有较大波动。本循环水养殖系统将氨氮及亚硝酸氮质 量浓度控制在安全范围内, 有利于保持良好水质, 促 进对虾生长(孙国铭等, 2002)。本研究中 3 个养殖池 硝酸氮质量浓度均呈上升趋势, 这与索建杰等(2015) 研究结果一致。硝酸氮质量浓度变化范围在 0.84~ 35.40 mg/L, 均值(14.04±0.38) mg/L。臧维玲等(2008) 在室内对凡纳滨对虾进行循环水养殖, 检测硝酸氮质 量浓度变化范围在 0.680~47.285 mg/L; 张龙等(2019)测 得循环水养殖硝酸氮质量浓度最高值达到 25.98 mg/L。 硝酸氮对对虾毒性作用较小, 浓度高于 150 mg/L 将对 南美白对虾的生长不利(彭自然等, 2004)。

2.2 对虾生长性能 由表 1 可知, 经过 63 d 养殖, 对虾平均体重达到 11.46~12.21 g, 产量为 3.14~3.54 kg/m3 , 生长率在 6.9%~7.5%之间, 存活率为 67.16%~72.48%, 饵料转 化率为 63.92%~80.13%。谢松平等(2015)在室内进行 工厂化循环水养殖凡纳滨对虾 125~140 d, 平均规格 在 80.6 尾/kg, 平均单位水体产量为 3.9 kg/m3 , 成活 率为 42.8%。张龙等(2019)比较了不同养殖模式对凡 纳滨对虾生长性能的影响, 发现经过 85 d 养殖, 循环 水养殖凡纳滨对虾存活率(74.58%±1.74%)、饲料转化 率(70.56%±3.82%)和产量[(3.91±0.49) kg/m3 ]显著高于流水养殖凡纳滨对虾存活率(66.90%±3.80%)、饲料 转化率(67.14%±3.25%)、产量[(3.47±0.42) kg/m3 ]。综 合以上数据, 本研究养殖效果较为成功, 其中 17#养 殖效果最好。 2.3 菌群组成丰度分析 根据 16S rRNA 测序结果, 将 Stat 和 Star 样本在 属水平物种丰度信息进行统计, 选取相对丰度排名 前 10 的菌属(图 3), 结果显示, 在循环水系统开始运 行期和平稳期生物滤池菌群结构差异较大, 在 Star 期, 滤料池中优势菌属为海杆菌属(Marinobacter)、别样 海源菌属(Aliidiomarina)、Planktosalinus、黄杆菌属 (Luteolibacter)、盐单胞菌属(Halomonas)、无色杆菌 属 (Leucobacter) 、远洋杆菌属 (Pelagibacterium) 、 SM1A02、ML310M-34 和 Saccharimonadales, 相对丰 度分别为 31.37%、9.33%、8.21%、7.25%、6.10%、 2.46%、2.35%、1.88%、1.75%、1.60%; 而在 Stat 期, 滤料池中优势菌属为 Parvibaculum (8.57%)、分枝杆 菌 属 Mycobacterium (6.65%) 、分枝菌酸杆菌属 Mycolicibacterium (6.39%)、食烷菌属 Alcanivorax (5.21%)、海杆菌属 Marinobacter (3.36%)、中慢生根 瘤菌属 Mesorhizobium (2.30%) 、固氮螺菌属 Azospirillum (1.42%)、红杆菌属 Rhodobacter (1.34%)、 副球菌属 Paracoccus (1.29%) 和硝化杆菌属 Nitrobacter (1.17%)。 不同时期生物滤池菌群结构出现演替性变化, 从而保证了循环水系统运行过程中水质的稳定。张斌 等(2008)在研究膜-生物反应器水质处理系统微生物 群落演替过程中发现, 水质的改变会导致微生物群 落结构多样性降低, 在反应器不同运行时期, 会出现 原种的消亡, 次级种群的强化和演变等过程。张海耿 (2011)也发现在生物挂膜初期, 最先适应此环境的细 菌迅速繁殖起来, 当系统运行后, 随着生物滤池中的 营养盐成分逐渐趋于稳定, 一部分细菌在竞争中被 淘汰, 而另一些细菌则慢慢成为优势种群, 还有一些 广泛存在的优势菌属, 在系统内物质和能量的代谢 中发挥着重要的作用。本研究中, 滤料池在 Star 期与 Stat 期菌群结构组成差异较大, 这可能是由于系统运 行前期水质变化较大引起的。海杆菌为两个时期共有 的优势菌属, 海杆菌是一种广泛存在的反硝化细菌,能够利用硝酸盐和亚硝酸盐作为氮源, 在反硝化作 用下将其还原成氮气, 从而达到脱氮的效果(巫亮等, 2014; Liu et al, 2016; 刘万鑫等, 2017)。在生物滤池开 始运行时期, 海杆菌占有绝对的优势, 亚硝酸氮迅速 下降而硝酸氮保持不变, 说明该阶段主要由海杆菌 反硝化作用占据优势(孟盈盈, 2019)。 氨氮与硝酸氮质量浓度逐渐上升, 亚硝酸氮维 持在 0.4 mg/L 以下, 在水质变化平稳期, 生物滤池中 优势菌主要包括分枝杆菌、分枝菌酸杆菌、食烷菌、 海杆菌、中慢生根瘤菌、红杆菌和副球菌等反硝化细 菌和硝化杆菌(Depkat-Jakob et al, 2010; 张芳, 2015; 杨浩等, 2018; 赵磊, 2019)。硝化作用是由氨氧化菌和 亚硝酸盐氧化菌共同作用完成的, 前者将 + NH -N4 氧 化为亚硝态氮( NO -N2 - ), 后者将 NO -N2 - 进一步氧化 为 NO -N3 - , 硝化杆菌是典型的亚硝酸盐氧化菌, 可 将大量的亚硝酸盐氧化为硝酸盐(孙洪伟等, 2018)。 在本实验中, 亚硝酸盐浓度较低而氨氮、硝酸盐不断 积累, 可能是由于硝化杆菌的作用, 但缺少将氨氮氧 化为亚硝态氮的氨氧化菌, 因此造成养殖环境氨氮 的积累(Gómez-Jiménez et al, 2005)。反硝化作用主要 是由厌氧反硝化细菌进行的还原反应, 可以将硝酸 氮(NO3-N)或亚硝酸氮(NO2-N)还原为 NH3、NO 和 N2 (吴伟等, 2013; 孙朦朦, 2014)。硝化-反硝化反应可以 通过两种途径实现, 一种是硝酸盐途径: NO2 - → NO3 - → N2 , 另一种是亚硝酸途径 NO2 - → N2 (张丹等, 2003)。在本实验中, 硝酸盐没有减少的趋势而且亚硝 酸盐没有堆积, 说明在养殖过程中主要以第二种途 径进行反硝化作用。

2.4 菌群基因功能分析 通过对比 KEGG 数据库发现代谢通路中碳水化 合物代谢 (carbohydrate metabolism) 和氨基酸代谢 (amino acid metabolism)含有的蛋白数目最多(图 4), 分别为 46 643 个和 40 092 个, 这与吕小梅(2014)研究 反硝化除磷污泥中菌群功能基因分布情况相似。 异养反硝化菌可以利用碳源作为电子供体, 将 硝态氮或亚硝态氮还原为气态氮, 而且利用有机碳 可为反硝化菌提供物质和能量, 以供其生存和繁衍 (刘刚等, 2010; 吉芳英等, 2013; 孙朦朦, 2014), 因此碳源对于细菌及反硝化过程起着重要作用。有研究表 明, 在乳酸菌中碳代谢作为关键代谢显著影响亚硝 酸盐的降解(潘晴, 2018)。此外, 氨基酸也可作为碳源 被反硝化细菌所利用, 陈元磊(2015)发现在两种反硝 化细菌基因组中, 碳水化合物传递和代谢、氨基酸传 递与代谢相关基因最多 , 分别占预测基因的 8.56%~11.21%、8.44%~10.22%。杨航等(2008)提出丝 氨酸、丙氨酸、组氨酸以及亮氨酸均可作为反硝化作 用的底物, 钱小青(2001)则发现反硝化脱氮菌能直接 利用甘氨酸或丙氨酸作为唯一碳源进行脱氮。在本研 究中, 丙酮酸代谢(pyruvate metabolism, 12.75%)、乙 醛酸和二羧酸代谢 (glyoxylate and dicarboxylate metabolism, 11.88%)在碳水化合物代谢中占有最高丰 度; 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(glycine, serine and threonine metabolism, 12.31%), 缬氨酸、亮氨酸和异 亮氨酸降解(valine, leucine and isoleucine degradation, 10.34%)在氨基酸代谢中占有最高丰度, 这说明在本 系统中, 有多种氨基酸及二碳、三碳酸作为碳源共同 参与反硝化过程。

3 结论 本凡纳滨对虾循环水养殖系统在养殖初期氨氮 与硝酸氮质量浓度逐渐上升, 水质变化逐渐趋于平 稳, 但是本循环水养殖系统始终将氨氮及亚硝酸氮 等水质指标浓度控制在安全范围内, 有利于保持良 好水质, 促进对虾生长。通过菌群组成丰度分析, 在开始运行期与水质变化平稳期生物滤池中菌群结构 差异较大。在开始运行期海杆菌属占绝对优势, 而在 平稳期则以分枝杆菌属、分枝菌酸杆菌属、食烷菌属、 海杆菌属、中慢生根瘤菌属、红杆菌属、副球菌属等 反硝化细菌和硝化杆菌属占据优势。在水质稳定期的 菌群基因功能分析中, 通过对比 KEGG 数据库发现 代谢通路中碳水化合物代谢和氨基酸代谢含有的蛋 白数目最多, 也进一步说明水体中反硝化菌可以利 用多种碳源进行反硝化作用来调节水质, 降低水体 中亚硝酸氮浓度, 使氨氮及硝酸氮平稳变化。 综上所述, 本研究通过 16S rRNA 测序及宏基因 组测序技术, 对生物滤池中菌群结构及功能进行了分 析, 结合养殖池水质指标变化, 发现对虾循环水养殖 系统菌群和水质变化具有明显的时序特征, 在水质变 化稳定期亚硝酸盐得到有效控制, 反硝化细菌为优势 菌, 可利用多种碳源进行反硝化作用。本次研究结果 将为循环水养殖系统中菌群结构与环境因子互作提供 参考, 为菌群结构和功能定向调节提供依据。