关键词: 异养硝化;医药化工废水;复合菌株;生物脱氮

                  氨氮是水环境污染重要元素之一，高浓度氨氮不但会导致水体富营养化，而且对水生动植物和微生物也有毒害作用。而医药化工废水具有高色度、高盐度、成分复杂、高氨氮、难生化降解、生物毒性大等特点，比其他工业污水更难处理，目前去除医药化工废水中氨氮主要有物理法、化学法、生物法，生物法因其具有经济高效、安全无污染等优点，而逐渐成为了研究和应用热点。

                      但依靠单一微生物处理废水氨氮难以有效去除，如黄廷林等人筛出不动杆菌属在 48 h 氨氮去除率仅为 41.33%。而生物脱氮中复合菌株之间能通过功效互补、共同作用高效地完成氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮的降解。通过搭配多种菌株进行复合培养，无论是氨氮去除效果还是处理时间远胜于单一菌株，且复合菌株具备更强环境适应能力，不易受到环境干扰。如蒙海林等人通过复合 3株异养硝化细菌氨氮去除率由 60.7% 提升到 71.2%。通过不同菌株复合的办法来提高污水处理能力和氨氮处理效果，为生物脱氮指明了新的方向。

                  目前国内外对复合微生物处理医药废水研究的较少。本研究从污水处理厂分离到一株具有高效氨氮降解能力的异养硝化细菌，结合实验室获得的一株好氧反硝化细菌 LX 1-3（Paracouccus）［7］，进行单一菌株和复合菌株的医药废水脱氮研究。通过复合菌来降解传统医药化工废水中氨氮，具有良好的应用前景与实践意义。

                    1 实验部分

                   1.1 材料

                   1.1.1 实验样品

                      菌株来源：江西沃邦兴环保科技有限公司污水处理厂活性污泥。污水来源：江西华邦药业有限公司的高浓度医药污水。 1.1.2 培养基改良 R2A 富集培养基：蛋白胨 5.0 g，酵母浸粉5.0 g，葡萄糖 5.0 g，酪蛋白水解物 5.0 g，KH2PO4 3.0 g，MgSO4 0.024 g，Tween-80 5.0 g，pH 7.1。异养硝化培养基：NH4Cl 0.38 g，MgSO4•7H2O 0.03 g，MnSO4•4H2O 0.01 g，K2HPO4•3H2O 0.5 g，FeSO4 0.4 g，葡萄糖 1.0g，pH 7.1。无机盐基础培养基：NaNO2 1.0 g，Na2CO3 1.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.75 g，FeSO4 0.4 g，pH 7.1。反 硝 化 培 养 基 ：KNO3 1.0 g，KH2PO4 1.0 g，FeCl2 0.5 g，CaCl2 0.2 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，琥珀酸钠8.5 g，pH 7.1。所有培养基经115 ℃灭菌30 min。

                       1.2 方法

                       1.2.1 菌株分离筛选

                       将活性污泥制成悬液，取 1%（v/v）悬液置于含100 mL 无机盐基础培养基的 250 mL 锥形瓶中，于28 °C、170 r/min富集培养 24 h，取 1 mL富集液接入到含100 mL R2A培养基的250 mL锥形瓶中再次培养。以 10-4～10-8浓度梯度下 100 μL 菌液均匀涂布于异养硝化培养基固体平板上，分离出具潜在硝化功能的细菌，多次划线纯化后于斜面培养基暂时保存。将初筛菌株接种到改良R2A培养基并于28℃、170 r/min的恒温摇床中富集培养24 h。富集菌液离心后用0.8%无菌盐溶液悬浮稀释至OD600为1.0，以 2%（v/v）接种量接于100 mL异养硝化培养基中培养48 h。每隔12 h用格里斯试剂检测亚硝酸根浓度的变化情况，选取硝化能力好的菌株，悬浮在 20% 甘油中于-80 ℃下保存备用。 

                       1.2.2 菌株形态学鉴定

                        将分离纯化到的菌株XTT于R2A平板上划线，对长出的单菌落进行形态学观察鉴定。

                          1.2.3 分子生物学鉴定

                       采用细菌 DNA 提取试剂盒（TIANGEN）提取XTT 基因组 DNA，根据 DNA 模板扩增 16S rDNA，扩 增 引 物 采 用 细 菌 16S rDNA 通 用 引 物 ：27F 和1429R。PCR 反应体系（40 μL）：Taq 酶 20 μL，上游引物和下游引物各 2 μL，模板 1 μL，超纯水 15 μL。PCR 反应条件：95 °C 预变性，2 min；95 °C 变性，30s；55 °C 退火，30 s；72 °C 延伸 90s；循环 30 次；最终72 °C 延伸，5 min。以 0.8% 琼脂糖凝胶电泳分析PCR 产物结果，将产物送至上海生工进行测序。最后将测序结果提交至 NCBI 数据库进行 BLAST 比对以确定目的菌株种属。

                     1.2.4 菌株硝化特性研究

                     1.2.4.1 单一菌株氨氮去除效果

                      将菌株 XTT 接入改良 R2A 液体培养基，置于28 ℃、170 r/min 培养 24 h，以 10%（v/v）的接种量将培养后的 XTT 菌液（OD600为 1.0）接入含 100 mL 异养硝化培养基的锥形瓶中，170 r/min、28 ℃培养。每隔 12 h 取 5 mL 水样用于氨氮的检测，连续取样4 d。

                      1.2.4.2 单一菌株培养方式优化

                       将菌液（OD600为 1.0）以 4 种不同培养方式处理医药污水：a）取10 mL菌液，以5 000 r/min低速离心5 分钟，弃去上清后用无菌水将菌体洗脱至 10 mL，再接入含 90 mL 污水的锥形瓶中，于 28 °C、170 r/min 摇床培养进行污水处理；b）处理方式与 a 相同，最后置于恒温培养箱静置培养；c）取 10 mL 菌液直接加入装有90 mL 污水的三角瓶中，于28 °C、170 r/min 摇床培养；d）处理方式与 c 相同，恒温培养箱静置培养进行污水处理。在 0、12、24、36、48、60、72 h七个时间段进行取样，测定水样中的氨氮含量。

                      1.2.5 复合菌株污水处理测试

                       1.2.5.1 复合菌株氨氮去除效果

                       将所得目的菌株 XTT 与一株好氧反硝化菌 LX 1-3（实验室已保存）复配处理污水，其中 LX 1-3用反硝化培养基培养。两菌培养到对数生长期后再离心菌体并用0.8%无菌盐溶液悬浮稀释至OD600为1.0，投入稀释10倍的江西华邦药业有限公司的污水中，以表1实验步骤进行污水处理在于验证复合菌株处理医药废水中氨氮效果。在 0、12、24、36、48、60、72 h七个时间段取样，测定水样中氨氮含量。

                        1.2.5.2 复合菌株配比优化

                         将 XTT 和 LX 1-3 菌悬液共 20 mL 按 1：1、3：1、 1：3（v/v）接种到装有 80 mL污水的锥形瓶中进行处理。在 0、12、24、36、48、60、72 h 七个时间段分别取5 mL污水样品，测定水样中氨氮含量。

                         1.3 分析方法

                         菌体密度的测定采用紫外分光光度法（OD600）；氨氮水样在 13 000 r/min 离心 3 min 后进行指标检测，氨氮浓度的测定采用纳氏试剂分光光度法。以上所有实验均重复3次。

                         2 结果与讨论

                         2.1 硝化细菌的分离筛选

                         2.1.1 菌株筛选与分离

                         通过梯度稀释以及平板划线分离筛选到5株硝化菌，选取氨氮降解能力最好的硝化细菌进行实验，将此菌命名为XTT。 

                            2.1.2 菌株形态鉴定

                           XTT菌落呈圆形乳白色，湿润，不透明，中央略突起，边缘整齐，菌落直径约 1.0～1.2 mm，表面光滑，质地均匀：菌体不易挑起，具备一定黏性。革兰氏染色实验鉴定菌株为革兰氏阳性细菌。

                           2.2 菌株分子生物学鉴定

                          测 序 结 果 表 明 XTT 16S rDNA 序 列 长 度 为1528 bp，将菌株 16S rDNA基因序列进行 BLAST同源 比 对 ，发 现 XTT 菌 株 16S rDNA 序 列 与Aquabacterium olei（MH251870）两者同源性最高，序列相似性达到 99% 以上，利用 MEGA 6.0 软件参考部分比对序列构建菌株系统进化树，可进一步确定菌株为Aquabacterium olei。

                        2.3 菌株硝化特性研究

                        2.3.1 单一菌株脱氮特性

以 NH4Cl为唯一氮源探究菌株 XTT硝化特性，结果如图1所示。处理前12 h中菌株氨氮处理效果一般，氨氮去除率缓慢增加，伴随着菌株生长繁殖，氨氮去除率在 12～48 h 急剧上升，在处理 48h 时去除率最高达到 69.2%。24 h后随着处理时间的延长去除率逐渐减小，这可能是由于硝化作用导致亚硝酸盐和硝酸盐积累，导致亚硝酸盐浓度过高，从而影响菌株生长［8］，也有可能是菌体进入衰亡期导致部分菌体分解死亡，胞内氮转化为胞外氮，培养液中氨氮含量逐渐回升，从而导致去除率总体下降。

                     2.3.2 单一菌株污水处理培养方式和接种方式优化

                      将 XTT按菌体菌液接种、静置摇床培养不同方式处理废水来探究其最适培养方式与接种方式（图 2），以 a（摇床培养）处理的 XTT 48 h 对污水的氨氮去除率达到了最高57.3%，而以b（静置培养）处理的XTT 氨氮去除率在 60 h 只达到了 44.5%。两组前48 h 氨氮去除率都稳步提升，在 48 h 后 a 组由于底物消耗、亚硝酸盐等毒害作用使菌体死亡而去除率下降。对比发现培养方式对 XTT 的生长及脱氮影响明显，微生物的生长代谢与生长环境中溶解氧浓度密切相关，氧浓度过高或过低都会影响微生物的生长代谢［9］，在静置培养时锥形瓶中溶氧可能较低而影响了微生物的生长代谢。对比图 6 c、d 也能发现以摇床培养的 XTT 菌体对污水去除率在 60 h 达到了 42.4%，比静置培养的去除率高。可知培养方式对于氨氮去除效果影响明显。再进一步探究接种方式对脱氮性能的影响，对比图6 a、c发现以菌液接种氨氮去除率明显比以菌体接种高。以摇床菌体方式培养去除率最高仅为 42.4%，以静置菌体方式培养去除率最高仅为 36.1%，以菌液接种比以菌体接种的脱氮效果更好，可能是菌液接种具有快速的分散速率，能迅速充分接触到底物［10］。另外单一菌对污水的氨氮去除效果在培养后期（60 h）下降明显，可能是医药化工废水中含大量难降解有机物，使生物生长脱氮过程受到抑制。结果表明以摇床培养菌液接种时菌株能更好适应医药污水中极酸和高氨氮的环境，并能够快速生长，符合实际工业污水处理要求。

                     2.4 复合菌株污水处理测试

                      2.4.1 复合菌与单菌污水处理对比

                       图 3 反应了 XTT 单菌、LX1-3 单菌与复合菌处理污水的能力对比，XTT 与 LX1-3 复合处理污水时前36 h氨氮去除率稳步提升并在36 h达到了最高效率为 64.0%，XTT 单独去除氨氮在 48 h 达到最好为62.3%，LX1-3菌株单独处理废水时氨氮在84 h达到最高去除率为 52.9%，表明 LX1-3也具备硝化能力。而复合菌处理时硝化反硝化过程同步，减小了亚硝酸盐等物质对硝化菌的毒害，从而使得XTT能持续快速的降解氨氮。48 h后前两组处理对氨氮的去除率都有所下降，可能是硝化反应产生的硝酸盐累积速率过快，也可能是硝化反应产生的酸度不能及时被反硝化反应产生的碱度所中和，导致 pH 下降，影响菌体生长、脱氮效果；第三组 LX1-3 菌株在 24～48 h之前去除率稍有下降可能是随着营养物质消耗医药废水中有害成分占比增多，部分菌体不能耐受死亡，而 48 h后剩余菌体更加适应恶劣环境从而使氨氮去除率再次提升。但从图中对比可知，异养硝化菌 XTT 和好氧反硝化菌 LX 1-3 以 1：1 接种量接入时的氨氮去除效果并没有很大的提高。这可能是由于二者接种比例不适宜引起的，需进一步探究复合菌株最佳配比率。

                         2.4.2 复合菌株配比优化

                         图4表示了复合菌株的不同配比对氨氮去除率的影响。24 h前以XTT/LX 1-3 3：1接种的比其他两组氨氮去除率高是因为硝化菌生物量占比较高，随着硝化产物积累，以硝酸盐为底物的反硝化菌发挥作用，反硝化菌生物量占比高的两组分别在60、84 h达到了最高的氨氮去除率。XTT和LX 1-3以1：3接种时氨氮去除效果更理想，处理 84 h后其氨氮去除率高达 95.6%，当复合菌株 XTT 和 LX 1-3 以 1：2 接种时氨氮去除率达到 80.6%，当复合菌株 XTT 和LX 1-3 以 3：1 接种时氨氮去除率最高仅为 75.1%。

                         当硝化菌和反硝化菌在同一反应器中配比适中时，硝化反应产生的酸可被反硝化反应产生的碱中和，酸碱中和可以维持反应pH稳定，有利于复合菌株生长繁殖。同时微生物的共代谢作用能高效同步协同处理污水，使硝化反应产物可直接用作反硝化反应的底物，避免了 NO2-的积累毒害菌株。所以与单一菌株单独处理医药污水相比，复合菌株的氨氮去除能力明显高于单一菌株，具有广阔的污水脱氮应用前景。

                          3 结 论

                         本研究从活性污泥中筛选到一株异养硝化细菌XTT，其氨氮去除率最高为 69.2%，经形态学与分子生物学鉴定该菌株为油酸亚种菌属（Aquabacterium olei）。对该菌株处理医药废水时的培养方法、接种方式进行优化，发现以摇床培养比以静置培养 XTT氨氮去除率更高，最高达到57.3%，以菌液接种比以菌体接种的脱氮效果更好，但是最高也仅为42.4%。为提高氨氮去除效果，将XTT与实验室之前获得的好氧反硝化菌 LX 1-3搭配混合培养，通过探究复合菌株的培养方法、接种方式以及配比率来优化其脱氮特性，结果发现将 XTT和 LX 1-3按 1：3的体积比接种时，培养 84 h 后医药污水的氨氮去除率高达95.6%。

                       复合菌株与单一菌株相比，有以下明显优势：反应条件相同，实现在同一反应器中同时进行硝化和反硝化作用，节省企业厂房占地面积和投资成本，复合菌株氨氮去除能力更强，污水处理效果更显著，硝化反应产生的酸可被反硝化反应产生的碱中和，反应过程中不需要再额外添加碱，酸碱中和有利复合菌群进行生物脱氮。复合菌株在处理医药污水中的氨氮表现优异，在污水处理方面有着重要意义及应用前景。下一步我们将探究复合菌株共同作用机理，优化复合菌株搭配，扩大处理污水体积，为复合菌株实际应用于污水处理摸索条件。

                         原标题：硝化菌的分离鉴定及多菌复配处理医药化工废水

                         原作者：熊 凯，文 鹤，廖焰焰，张盼文，杨慧林，王筱兰